El uso de vectores virales en la terapia génica. Consecuencias y beneficios



Introducción

La corrección o anulación de un defecto genético causante de enfermedad o en su defecto la potenciación de algún o algunos caracteres genéticos son los planteamientos premisa de la Terapia Génica. El primer concepto es aceptado por la sociedad en general y el segundo solo es aceptado por pocos individuos.

Los fenómenos alterantes físicos, químicos, biológicos o sintéticos, modifican la constitución genética y por ende fisiológica de los organismos. Estar a la vanguardia de los cambios acelerados del presente y su eventual drástico daño genético, es una prioritaria necesidad.

Los procesos genéticos y bioquímicos básicos de la célula, la replicación del ADN (ácido desoxirribonucléico), la activación de un gen, la transcripción y el procesamiento del ARNm (ácido ribonucleico mensajero), la traducción del ARNm a proteínas, la degradación del ARN, el tráfico intracelular de proteínas, y la programación de la división y muerte de una célula, son prácticamente idénticos a través de toda la escala evolutiva (Isamat M. 2013). Siendo reconocidos hoy en día estos procesos y sus mecanismos de activación, lo único que hacía falta eran los vehículos que facilitaran elementos de transferencia de uno a otro individuo y con la manipulación tecnológica de inserción genética como la Microinyección, la Precipitación con fosfato cálcico, la Electroporación, el Bombardeo con microproyectiles, la Inyección directa de ADN "desnudo", Liposomas. (C. L. Ronchera-OMS, J. Mª. González. 2012), esta barrera se ha ido rebasando y dejando el camino potencialmente abonado para múltiples nuevos usos. Ahora existen también los vehículos virales que ha ido revolucionando la forma de trasferir material genético. Las expectativas de ensayo para la medicina en el tratamiento de algunas enfermedades primeramente de tipo monogénicas son muy alentadoras.

A este tipo de metodología para evitar o modificar las alteraciones genéticas en los organismos se denomina Terapia Génica (TG) y constituyen una novedosa alternativa terapéutica para muchas enfermedades cuando las terapias habituales no han tenido efecto. Básicamente la TG consiste en la introducción de material genético en el interior de una célula diana con el objeto de producir en ella un cambio funcional que se traduzca en un efecto terapéutico y reproducible a otras células. Actualmente existe un amplio abanico de vectores para transferencia génica, sin embargo no se dispone del vector ideal que pueda ser tan versátil como para adaptarse a las numerosas situaciones experimentales o clínicas. (I. Narvaiza, G. Mazzolini, C. Qian, J. Prieto, I. Melero 2003). Dentro de este inmenso maremágnum de agentes existen vectores virales y no virales, pero solo un pequeño grupo ha sido blanco de investigación al uso como insertores, acopladores, translocadores o transfectores de material genético (secuencias genéticas) de manera medianamente estable y satisfactoria. Sucesivo a esto, su uso se ha visto restringido hasta lograr encontrar patrones de manufacturación totalmente acertados, inocuos, especialmente compatibles y con elevada probabilidad de manipulación estable, respuesta positiva y perpetuación de los factores corregidos y/o agregados.

Actualmente, dentro de los múltiples beneficios, que el inteligente uso de micro y macrorganismos de forma física y/o química nos permiten y su participación en la mitigación para inmensidad de variados desórdenes biológicos y genéticos un aliado inesperado, como se mencionó anteriormente, son los virus como importantes vehículos de trasferencia génica.

Por mencionar la relevancia de sus bondades y posibilidades, intentaré desenmarañar y con esto procurar comprender algo estos agentes virales, empezando con parte de su historia, sus mecanismos de modificación, la respuesta inmune, los vectores virales de mayor uso en TG, Adenovirus, Adenoasociados, Herpesvirus y Retrovirus, los cuales se han convertido en la forma más eficaz de transferir o modificar genes terapéuticos al interior de las células diana (Smith AE. 1995). También se analizará sus limitaciones así como sus beneficios, para terminar dando un punto de vista particular del uso de los vectores virales en la TG.

Historia y generalidades de los virus

Información obtenida de variados textos:

http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen2/ciencia3/071/htm/sec_20.htm

Los virus están ampliamente distribuidos en la naturaleza, son incapaces de reproducirse independiente, han sido aislados de plantas, algas, hongos, bacterias, protozoarios, invertebrados, anfibios, reptiles, peces, aves y mamíferos.

El término virus tiene varios siglos de existencia. La disciplina científica hoy día conocida como virología apenas se remonta a las décadas finales del siglo XIX. Un caso específico es la enfermedad conocida como la "rabia" descrita y registrada meticulosamente por más de dos mil años. Si se comparan las antiguas descripciones hechas por cronistas griegos y romanos con los casos más recientes de rabia tanto en animales como en humanos, encontramos desde el punto de vista clínico, el virus de la rabia no ha cambiado a lo largo de los siglos. Esta característica lo distingue de otros virus patógenos (capaces de producir enfermedad), confiriéndole una posición única en la historia de la medicina.

Celso un médico que vivió en el siglo I, en el apogeo del imperio romano describe, en el libro De Medicina, ante la denominada rabia con las siguientes palabras: "especialmente en los casos en que el perro es rabioso, el virus debe ser drenado con una ventosa de vidrio..." Celso identificó al agente de la rabia como un virus aunque no el sentido moderno del término, se cree, pues el término latino virus significa veneno o líquido viscoso.

Adquiere la connotación actual de agente infeccioso, en el siglo XVIII, debido a la creciente advertencia general de que existen muchas enfermedades contagiosas y transmisibles.

Paralelamente en los siglos XVII y XVIII, se manifestó la viruela como epidemia en Europa, -talvés de cepas diferentes a las arrasadoras que marcaron la invasión mesoamericana y al exterminio de grandes imperios como el Azteca o el Inca-, y en estas mismas épocas en la China se desarrolla una terapia denominada variolación, la cual consistió en la inoculación de individuos sanos con fluidos obtenidos de las vesículas eruptivas de personas afectadas por casos leves de viruela.

En 1721, Mary Worfley Montagu, esposa del embajador británico en Turquía, introdujo la variolación en Gran Bretaña. Algunos autores se permitieron especular sobre la naturaleza de aquel agente transmisible causa del contagio con viruela, al cual se denominó virus cada vez con mayor frecuencia.

En 1764 Angelo Gatti hizo unas observaciones para atenuar el "virus varioloso" pero no publica sus resultados y en 1798 fallece. Ese mismo año el médico británico Edward Jenner, discípulo de Gatti, comunica que la inoculación con el virus como vacuna (o sea, con los fluidos obtenidos de las lesiones de la viruela bovina), eran capaz de prevenir la infección de la viruela en seres humanos, dando los inicios a lo hoy conocido como anticuerpos sintéticos.

A principio de siglo XIX, y solo por mencionar algunos de ellos, Claude Bernard, aplica la misma metodología en la observación directa de las garrapatas. Claude Davaine en 1860 utiliza una combinación de experimentación y observación para rastrear el bacteridium del ántrax. Robert Koch observó en 1876 que el bacilo del ántrax a veces forma pequeñas esporas capaces de atravesar la membrana placentaria.

Por lo tanto, durante mucho tiempo el término virus fue restringido a denotar una misteriosa entidad infecciosa capaz de ejercer su efecto patogénico solamente por medio de la asociación en solución de ciertos elementos o partículas de naturaleza desconocida.

Los avances en el conocimiento de los virus se atribuyen, en gran medida, a los estudiosos de la microbiología, bacteriólogos, pues gracias a ellos en procura de encontrar los microorganismos u "orgánulos" como les llamaron en su época, con estos esquivos individuos, al presente les podemos reconocer. Louis Pasteur al tiempo con Dimitri Ivanovski en 1892 hicieron también sus aportes al demostrar que el agente causal de la enfermedad vegetal, conocida como mosaico del tabaco era capaz de pasar a través de los filtros a prueba de bacterias y no podía ser observado bajo el microscopio ni cultivado en medios artificiales.

Más adelante en 1898 Martinus Beijerinck concluyó que debía tratarse de una substancia disuelta o soluble y, por lo tanto, de naturaleza molecular, quizá soluble en agua y capaz de replicarse, aunque solamente cuando se encontrara incorporada al protoplasma de la célula viva infectada; siendo lo más cercano al moderno concepto de virus.

Peyton Rous encontró en 1911 que algunos tumores sólidos, conocidos como sarcomas de los pollos, podían ser transmitidos a pollos sanos por medio de un filtrado obtenido a partir de células tumorales.

Otros aportantes a este concepto lo fueron F. Twort 1915; Félix d'Herelle 1917, por sus análisis con bacterias, al encontrar elementos no recuperables solo deducibles a los cuales denominaron "bacteriófagos" hoy reconocidos como virus de las bacterias. Estas partículas no podían ser visualizadas a través del microscopio, siendo este término de uso general, por largo tiempo, para algún patrón de afectación desconocida.

La primera purificación de un virus fue lograda por Max Schlesinger en 1933 utilizando una técnica conocida como centrifugación diferencial. El análisis químico de los fagos purificados demostró que están compuestos por proteínas y ácidos nucleicos en proporciones casi iguales.

Transcurrido el año de 1952 Renato Dulbecco, en un ensayo particular, cultivó células animales en una caja de cultivo hasta formar una monocapa, retiró el agar nutritivo y agregó un agente viral diluido a su incubación hasta que las células la embebieran, agregó de nuevo agar y volvió a incubar, pasado unos días realizó tinción con un colorante que solo penetra en células vivas, mientras que las no teñidas se determinan muertas. Demostrando así que la partícula infectante "fago" se multiplicaba dentro de la bacteria y que su progenie era liberada después de la lisis de la bacteria hospedera. En ensayos posteriores observó que obedecía a factores tanto dependientes como independientes, concluyendo con esto que la infestación al darse en bajas concentraciones era reabsorbida por la célula, mientras que en altas concentraciones propiciaba su ruptura, al ser captadas por la capa celular, produciendo la lisis y su posterior propagación.

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Gráfica desarrollada por Renato Dulbecco

La inactivación de los virus a través de cambios de temperatura se realizó principalmente por Avery, Mac Leod y Mc Carty, aislando sus componentes, y por acción complementaria de centrifugación, descritas por Hershey y Chase, demostraron que la proteína de la cubierta viral no es necesaria para producir la afectación debido a que no contiene la información genética.

Luego se encontró que los virus sufren mutaciones y que estos son sensibles a la temperatura, al lograr desnaturalizar la molécula generalmente por encima de 25°C (Epstein 1963).

A la fecha se conoce que los virus son partículas muy pequeñas, entre 20 y 300 nanómetros (nm = 1 millonésima parte de 1 milímetro). Mientras que las bacterias se miden en micras (&µ) o micrómetros (&µm), los virus se miden en milimicras (m&µ) o nanómetros (nm), que son unidades mil veces menores, y en Angstroms (?), que son diez mil veces menores.

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Experimento de Hershey y Chase

Únicamente son visibles los virus en microscopio electrónico. Su infección puede darse por medio de la interacción directa entre la célula y la partícula viral o transmitidos por un agente animal o vegetal que actúe como vehículo intermediario. También se sabe que los virus pueden contener ARN o ADN, no se han encontrado con las dos moléculas al tiempo, así como también presentan una partícula viral completa e infectiva denominada virión. Que su estructura proteica protectora es conocida como cápside y que ayuda en su ensamblaje; pueden tener cubiertas lipídicos o hasta presentar más de una envoltura, que éstas se constituyen de capsómeros, y que todo este conjunto se le denomina nucleocápside, además puede presentar variadas morfologías: cilíndricas, esferoides o icosahédricas. En cuanto el genoma y sus demás proteínas íntimamente asociadas se denominan "core" o "nucleoide.

Estas nanoscóspicas máquinas biológicas, se han estado visualizando por la ciencia moderna como poderosas salvadoras para la corrección de mutaciones en un principio somáticas y en un futuro, talvés no lejano, germinales, actividades aún inmersas en contradicciones y/o cuestionamientos éticos de la población humana.

El conocimiento de las propiedades de los virus y la relación que ellos establecen con su huésped es crucial para la investigación exitosa, en cualquier campo de la medicina donde se desee intervenir.

Replicación de los virus

La replicación se inicia cuando el virus entra en la célula, las enzimas celulares eliminan la cubierta y el ADN o ARN viral se libera y entra en contacto con los ribosomas, dirigiendo la síntesis de proteínas. El ácido nucleico del virus se autoduplica y, una vez que se sintetizan las subunidades proteicas que constituyen la cápsida, los componentes se ensamblan dando lugar a nuevos virus (López M. et al., 2004).

1. Ingreso del virus en la célula huésped;

2. Enzimas celulares degradan la cubierta y se descompone el virus;

3. El ARN o ADN entra en contacto con los ribosomas y dirige la síntesis de sus proteínas;

4. El ácido nucléico de los virus se autoduplica y sintetiza subunidades protéicas de la cápside;

5. Se ensambla y genera nuevos virus.

Una única partícula viral puede originar una progenie de miles -son hermafroditas-. Determinados virus destruyen la célula infectada -líticos-, otros salen de la célula sin destruirla por un proceso de exocitosis que aprovecha las propias membranas celulares -lisogénicos-. En algunos casos las infecciones son "silenciosas", es decir, los virus se replican en el interior de la célula sin causar daño evidente.

Los virus que contienen ARN se autoduplican sin la intervención de ADN. En algunos casos, el ARN viral funciona como ARNm, se replica de forma indirecta utilizando el sistema ribosomal y los precursores metabólicos de la célula huésped. Otros virus de ARN, los retrovirus, pueden producir una enzima que sintetiza ADN a partir de ARN –Retrotranscriptasa-. El ADN formado actúa entonces como material genético viral.

Tipos de virus

El ácido nucleico es la estructura química fundamental en la que reside la continuidad genética de los virus. Este ácido nucléico puede ser del tipo ARN o ADN. Hay que destacar que los únicos organismos existentes en la naturaleza cuyo genoma está formado sólo de ARN son los virus.

Virus de ARN

Los virus de ARN son unos parásitos intracelulares obligados cuyo genoma está codificado en una molécula de ARN. Estos virus se caracterizan por presentar altísimas tasas de mutación (del orden de una mutación por genoma y ronda de replicación), gran capacidad replicativo, pequeñas longitudes de genoma (con un tamaño medio de unos 10 Kb), y grandes tamaños poblacionales (Domingo et al., 2001a; Holmes, 2009), citado por Héctor Tejero Franco 2013.

Los virus de ARN según clasificación del ICTV (International Committee on taxonomy of viruses) pueden tener cadenas simples o dobles (monocatenario/bicatenario). Además de estas características físicas y químicas también se debe tener en cuenta la "polaridad" o sentido de la cadena de ARN. Polaridad positiva (secuencia de las bases constituyentes del ARNm), permite que constituya automáticamente las proteínas virales y polaridad negativa cuando al ingresar debe ejecutar su cadena complementaria, para fabricar las proteínas virales, esto es posible al presentar, adicionalmente, proteína transcriptasa o desarrolladora de dicha cadena.

Virus de ADN

La mayoría de los virus con ADN presentan un genoma bicatenario, con excepción de los parvovirus, constituidos por ADN monocatenario. Las moléculas de ADN viral pueden ser lineales o circulares, confiriendo ventajas al ácido nucleico respecto de la estructura lineal, otorgando protección frente al ataque con exonucleasas, facilita la replicación completa de la molécula y su posible integración al ADN celular.

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http://es.slideshare.net/yudyagui/clase-1-estructura-compos-adn-y-proteinas

Inmunidad

Capacidad que tiene el organismo de prevenirse ante una enfermedad. Es innata y adaptativa pues madura y se consolida en el curso de la vida. Todo este sistema está integrado por el conjunto de células y moléculas (antígenos), interconectados con sutiles señales imperceptibles para los microscopios, pero evidenciables en las vías bioquímicas del organismo, que funcionan como indicadores de alteración corporal ante cualquier tipo de sustancias, generalmente proteínas en la superficie de las células, virus, hongos, bacterias, toxinas, fármacos o ente extraño que ingrese al cuerpo. Estas células se conocen como anticuerpos, siendo sintetizadas por células del sistema inmune linfositos B y T y células derivadas de ellas, que se interrelacionan con los antígenos (cuerpos invasores). Estos forman complejos inmunes y se pueden encontrar en la sangre (plasma), saliva, lágrimas, secreciones mucosas, intestinales, etc. (Velandia. L. M & Castellanos. J. E. 2011). También pueden ser específicos (monoclonales) o multifactoriales (policlonales). La inmunidad se puede dividir en dos grandes grupos:

Inmunidad innata:

O respuesta primaria, aquella que reacciona gracias al sistema adquirido por los anticuerpos filiales.

Inmunidad adquirida o adaptativa

Respuesta tardía, luego de presentarse una infección o agente extraño, del cual el sistema inmune no tiene memoria de su invasión. Cuando sucede una infección en el sistema inmune, las células antígenas, en este caso linfocitos T, detectan las células enfermas, desarrollan las proteínas de defensa, con ayuda de interleucinas (comunicadoras celulares), destruyen las células perjudicadas, fagocitan estas células (generalmente macrófagos) y guardan dicha información.

La barrera hematoencefálica BHE

La barrera hematoencefálica es uno de los grandes sistemas defensivos del ser humano. En esencia, es un conjunto de tejidos que actúan como filtro entre el sistema sanguíneo y el sistema nervioso central: mientras dejan pasar el oxígeno y los tejidos, impide el paso de sustancias tóxicas que podrían dañar a nuestras neuronas.

Referente a los daños que pudiera sufrir la BHE por virus, se ha podido comprobar por medio de una técnica de perfusión con el colorante de azul de Evans que el virus de la influenza aviar produce daño en la barrera hematoencefálica, en forma similar a como lo hacen otros virus que también inducen viremia, tales como el virus de la inmunodeficiencia de los simios, el virus del Sarampión, el citomegalovirus humano, el virus de la leucemia de células humano, y el virus del Nilo Occidental, la utilización de los nervios craneales para el ingreso del virus al cerebro es remota, debido a que los núcleos neurales de nervios como el trigémino y el nervio vago, concluyendo que se produce infección por medio de la vía hematógena (A. J. Chaves et al., 2011)

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http://www.xataka.com/medicina-y-salud/tratamientos-sin-fronteras-atravesamos-de-forma-no-invasiva-la-barrera-hematoencefalica-por-primera-vez

Patogenicidad y virulencia

Los virus y sus modelos de infección son el primer elemento a indagar en este interrogante, que si se conociera a plenitud, no tendría lugar estar realizando esta revisión y por lo tanto debemos tener claro en qué lugar nos encontramos frente al dominio de los virus.

Continuemos por analizar la diferencia entre patogenicidad y virulencia, descritas como la capacidad de un virus de producir enfermedad, pero algunas veces uno se confunde con estos términos y hasta los puede considerar sinónimos, sin embargo Julio Reyes Leyva y sus acompañantes de la UNAM, en el artículo "Mecanismos moleculares de la patogenia viral: estudios con el Rubulavirus porcino. 2002", nos lo aclaran de la siguiente manera: "...patogenicidad se refiere al tipo de alteración producida por una infección, siendo comparable entre diferentes virus y la virulencia es la severidad del daño causado por diversas cepas del mismo virus…"

Atenuación de vectores virales

Sin dejar a un lado la clásica preparación de vacunas, y en el caso particular las vacunas vivas, que es lo en TG se utilizan, virus activos con sus propiedades infecciosas intactas, mencionaré vagamente algunas técnicas de atenuación de un virus:

Dicha atenuación debe ser lo bastante fuerte para que no se produzca de nuevo la enfermedad, sin llegar a destruir el componente inmunogénico desencadenante de la respuesta inmune:

Técnicas de atenuación viral

- Patógenos animales: Empleo de patógenos de animales que causan enfermedad parecida en los humanos y proporcionan inmunidad frente al agente infeccioso que causa la variante humana. Ej.: Viruela.

- Atenuación por pases sucesivos de cultivos celulares: cultivo sucesivo del microorganismo en células hasta la pérdida de la patogenicidad. Ej.: Tuberculosis, polio, sarampión, rubeola, parotiditis, y varicela.

- Atenuación por pases sucesivos en medios de cultivo: cultivo sucesivo del microorganismo en medios de cultivo hasta la pérdida de la patogenicidad. Ej.: Tuberculosis.

- Atenuación por medios químicos: mediante agentes mutagénicos químicos (nitroso-gaunidina). Ej.: Fiebre tifoidea.

-Atenuación por reasortado o recombinación: coinfección de dos virus con genomas diferentes en cultivos celulares, hasta formar un virus recombinado. Éste se compone de la mayoría de los genes de un virus animal no patógeno para el hombre, y genes que contienen los genes del antígeno inmunizante. Ej.: Rotavirus.

- Atenuación por mutagénesis: selección de mutantes en función de su capacidad de multiplicarse a temperaturas diferentes a la del cuerpo humano. Estos mutantes se replican con menor intensidad que la variantes salvajes, con lo que serán menos virulentos sin perder su inmunogenicidad (mutantes sensibles a la temperatura o TS). Ej.: Rotavirus, gripe. (López M. et al., 2004).

Técnicas de ADN recombinante (transferencia y transmisión del material genético)

La información genética de las células se encuentra almacenada en el ácido desoxirribonucleico (ADN) en forma de un código, denominado código genético. Un segmento de ADN de localización cromosómica precisa que contiene el código para un producto (proteína o ARN) con función definida es denominado gen. La información del gen es transferida a los diferentes compartimentos celulares a través del ácido ribonucleico (ARN) y es transmitida de una célula madre a las hijas por duplicación del material genético (ADN).

El proyecto Genoma Humano, estableció las pautas para el conocimiento de la secuencia completa del ADN humano, ubicando entre 30 y 40 mil genes en cerca de 3200 millones de nucleótidos (Bustos Jaimes I. et al., 2008).

Implantación viral

Resumiendo a groso modo, como se genera una implantación viral de forma natural, en un organismo esta puede ser considerada así:

Se requiere una regulación celular específica, que permita la expresión génica a lo largo de los procesos de desarrollo o en diferentes tejidos. Esto depende de dos etapas consecutivas:

1. El desplegamiento o apertura de la cromatina.

2. La formación de un complejo de iniciación, (factores transcripcionales generales y específicos), en general interacción de secuencias de ADN viral -elementos cis-; con proteínas activadoras alternas -elementos trans- (M. Esperanza Cerdán Villanueva 1993).

Aunque el hecho de adecuar proteínas con diferente isomería para el cambio de un factor trascripcional en un complejo viral y con ello modificar la capacidad virulenta, como se entiende en el modo natural, no resulta ser factible al momento de su aplicación in vitro, ósea no está exento el virus de revestirse. Y esto se puede entender por el hecho de comprender que las interacciones genómicas, celulares o cromosomales y en general de todo sistema, no son particulares sino asociativas.

Características generales de los genes

La estructura del gen se compone de varias zonas. El gen per se, es la secuencia de ADN que codifica la proteína (exón) y se ve interrumpida por secuencias no codificantes (intrón) que no contienen información sobre la proteína y sirven de "espaciadores". Además, antes del gen existe una secuencia, específica para cada gen, que se llama región promotora o promotor. Esta secuencia regula la expresión del gen que le precede. Es decir, controla que la fabricación de la proteína que codifica ese gen se haga en la célula que la necesite y en el momento que la necesite. De ahí, que la identificación estructural de un gen no sea siempre evidente y se deban buscar motivos específicos de la secuencia para delimitar el inicio de la transcripción y las fronteras entre exones e intrones.

La identificación funcional de un gen tampoco es fácil. Muchas veces se ha identificado la secuencia (o estructura) de un gen, pero se desconoce la función o el papel fisiológico que juega la proteína que de él se fabrica. Esto es común a muchas secuencias que se han identificado fruto del proyecto genoma humano, y cuyas funciones biológicas se desconocen. Existen varias maneras de averiguar la función fisiológica de un gen, y a menudo son necesarios varios enfoques. Se puede desactivar ese gen específico del genoma de un organismo vivo, por ejemplo un ratón, generando un ratón knockout, y después evaluar los síntomas que el animal knockout padece. No obstante, la mayoría de las funciones de genes involucrados en enfermedades genéticas hereditarias se han descubierto al comparar fragmentos del genoma de individuos afectados por la enfermedad y de individuos sanos, y su función se ha inferido por el defecto fisiológico que los enfermos padecen (Isamat M. 2013).

Terapia Génica

Definida como la transferencia o introducción de material genético para modificar el repertorio genético de células, destinada a curar enfermedades de origen tanto hereditario como adquirido. Las enfermedades posibles de tratar con esta estrategia terapéutica incluyen desde las monogénicas hereditarias hasta las poligénicas e infecciosas; dada esta diversidad, cada enfermedad requiere un abordaje particular. Las opciones en la manipulación genética son variadas e incluyen la adición o supresión de genes. La adición de genes (insertar un gen funcional que exprese la proteína terapéutica en el tejido indicado), incluye la corrección de genes defectuosos, insertar genes para inducir funciones nuevas o incrementar la expresión de un gen de interés. Por otro lado, la supresión génica se realiza a través de ARN de interferencia, oligonucleótidos anti-sentido o bien ribozimas (enzima del ácido ribonucleico) para disminuir o anular la expresión de genes.

Según el procedimiento que se aplique a las células para introducir el gen, la TG se divide en ex vivo e in vivo. En la terapia ex vivo las células a transfectar son cultivadas para posteriormente introducirles el material genético; una vez que estas células expresan el gen terapéutico son introducidas nuevamente al paciente. Por otro lado; la terapia in vivo consiste en la introducción directa del gen terapéutico al torrente sanguíneo o en la administración directa en el órgano o tejido diana. Cuando la TG se aplica en células germinales se origina un cambio permanente de todo el organismo y en generaciones posteriores (Bustos Jaimes I. et al., 2008).

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http://ies.gonzalotorrenteballester.climantica.org/

Se denomina transducción al uso de vectores virales en la TG o transfección cuando se usan vectores no virales.

Transformación de vectores virales para TG (Transducción)

Los vectores virales presentan una mayor eficiencia de transducción comparados con los sistemas no virales, por lo que son los vectores de elección en los modelos in vivo y en protocolos clínicos de TG. Hasta el momento se usan retrovirus, adenovirus, adenoasociados, herpesvirus y baculovirus. Para su uso como vectores, los virus son modificados genéticamente para que sean deficientes en replicación; en algunas ocasiones además, su cápside es modificada con la finalidad de dirigir o re-direccionar su célula blanco.

Con base en la naturaleza de su genoma los vectores virales pueden ser divididos en vectores de ARN y ADN; dada su capacidad de integrar o no su genoma viral dentro del ADN cromosómico de la célula huésped, pueden ser clasificados como vectores integrativos o no integrativos.

Los vectores integrativos se basan en retrovirus; los no integrativos incluyen a los vectores adenovirales (Ad), virus adeno-asociados (AAV) y los virus de herpes simple tipo 1 (HSV-1) (Bustos Jaimes I. et al., 2008).

Las características de un vector viral ideal para poder adaptarlo luego a situaciones concretas serían las siguientes:

- Que sea reproducible

- Que sea estable

- Que permita la inserción de material genético sin restricción de tamaño

- Que permita la transducción tanto de células en división como en reposo (quiesentes)

- Que posibilite la integración específica del gen

- Que reconozca y actúe sobre células específicas

- Que la expresión del gen pueda ser regulada

- Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune

- Que pueda ser caracterizado completamente

- Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios

- Que sea fácil de producir y almacenar a coste razonable (Fernández P. N. 2008).

Los vectores virales se obtienen por eliminación de uno o más genes indispensables para la replicación del virus, y su sustitución por el gen terapéutico. De esta forma, el nuevo virus es defectivo, lo que significa que mantiene la capacidad de infectar las células pero es incapaz de multiplicarse en ellas. Es decir, un virus puede ser transformado estructuralmente mediante diversas técnicas, dando lugar a un vector recombinante relativamente seguro, siempre y cuando se sustituya los genes responsables de su replicación y virulencia por los genes terapéuticos, manteniendo su capacidad infectiva intacta (C. L. Ronchera-OMS, J. Mª. González. 2012).

El sistema inmunitario en vertebrados superiores (cuyos efectores específicos son proteínas) sirve de barrera defensiva frente a virus y otros agentes exógenos, y el reciente sistema descubierto en 2002 denominado "ARN de interferencia" (cuyos efectores específicos son pequeños ARN, de 20 a 25 nucleótidos), activan o inactivan proteínas (Flores R. et al., 2007), pueden ofrecer una barrera para la efectividad al ingreso del nuevo agente corrector viral, pues sería detectado como cuerpo extraño. Para evitar este inconveniente, la modificación y/o sustitución de secuencias genéticas, deben también acoplarse en el vector viral compatibilidades con el sistema inmune del paciente.

Diseño de vectores virales empleados en TG

Para modificar un virus y transformarlo en un vector de transferencia génica, el primer paso es bloquear su capacidad de propagación eliminando los genes responsables de su replicación. El segundo paso es la eliminación de parte del genoma viral para crear espacio para introducir el material genético de interés (gen o genes, más los elementos de control). Se han de eliminar genes que no sean esenciales, y especialmente aquellos que puedan resultar tóxicos o perjudiciales para el individuo a manipular.

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Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas Juan A. Bueren

Vectores virales empleados en TG

Vectores Derivados de Adenovirus

El análisis de los Adenovirus o grupo de virus con ADN sin envuelta, no están asociados con ninguna enfermedad severa ni originan tumores en animales, ósea se consideran de baja o nula patogenicidad. El prefijo Adeno deriva del término latino glándula, estos virus se aislaron por primera vez en las amígdalas y en las glándulas adenoideas de humanos (Herrera M. L 2012). Pueden transducir un número bastante amplio de tipos celulares distintos, tanto para células en división como post-mitóticas, con una eficacia muy elevada. El genoma viral se mantiene episómico, lo que permite una expresión genética transitoria (Fernández. P. N. 2008).

Los Adenovirus (Ad) son virus icosahédricos de 60 a 90 nm de diámetro, con un ADN de doble cadena y un tamaño aproximado de 30 a 40 kb. Comprenden más de 50 serotipos humanos diferentes, así como también de primates no-humanos, ratón, perro, cerdo, pollo, pato y otros. Una vez el virus infecta la célula, el ADN viral permanece episomalmente en el núcleo, dirigiendo la expresión del gen de interés. Para el desarrollo de los vectores adenovirales de primera generación, la principal estrategia consiste en eliminar secuencias necesarias para la expresión de genes encargados de la replicación viral, reemplazándolas por el gen de interés, por lo que es necesaria una línea celular que contenga estas secuencias para la producción de las partículas virales. Los vectores adenovirales de segunda generación poseen deleciones adicionales, mientras que en los de tercera generación o vectores de alta capacidad, todas las secuencias virales han sido removidas (Alméciga, C.J et al., 2006). Recientemente se ha conseguido eliminar casi todo el genoma viral, manteniendo las secuencias de empaquetamiento y las secuencias terminales, rindiendo vectores que pueden incorporar hasta 35 kb a los que se les ha denominado "vectores sin tripas" (gutless). (Fernández. P. N. 2008).

Puesto que la capacidad del genoma adenoviral para dirigir la producción de adenovirus, lo cual reside en las secuencias iniciales, las estrategias para producir vectores adenovirales consisten en eliminar dichas secuencias e incorporar en su lugar el gen terapéutico, generando así un vector adenoviral sin capacidad de replicación. La amplificación del vector se lleva a cabo utilizando una línea celular complementaria, conteniendo la secuencia inicial en su genoma. Por último, el vector adenoviral conteniendo el gen exógeno se transfiere a la célula blanco. El ADN transferido permanece como un ADN episomal, dirigiendo la expresión del gen de interés (Alméciga, C.J et al., 2006).

Vectores de virus Adenoasociados (VVA)

Los virus Adenoasociados (VAA) son parvovirus humanos no patológicos, sin envoltura con un genoma de ADN monocatenario, capaces de infectar un gran número de células de origen diverso, tanto en división como en su estado quiescente. Pueden integrarse en la célula hospedadora en un lugar específico del genoma, eliminando la posibilidad de mutagénesis insercional. Otra ventaja es la carencia de respuesta inmune observada "in vivo". (Fernández. P. N. 2008). Pueden integrarse específicamente en el cromosoma 19 con alta probabilidad. Sin embargo, el VAA recombinante que se usa como vector y que no contiene ningún gen viral, solo el gen terapéutico, no se integra en el genoma. En su lugar, el genoma vírico recombinante fusiona sus extremos a través de ITRs (Repeticiones Terminales Invertidas), apareciendo recombinaciones de la forma circular y episomal que se presume puede ser la causa de la expresión génica a largo plazo. Al tratarse de un virus no patógeno en la mayoría de los pacientes tratados no aparecen respuestas inmunes para eliminar el virus ni en las células con las que han sido tratados (Misra S. 2013).

Vectores del Virus Herpes Simple

El virus Herpes Simple tipo I (HSV-1) tiene un genoma lineal de doble cadena de ADN de 152 kb (Wang S, Vos J. 1996), es neurotrópico y se ha utilizado para mediar la transferencia génica al sistema nervioso. (Kennedy PGE. 1997 & Wood MJA et al., 1994). El HSV-1 nativo es capaz de infectar neuronas y hace ciclo lítico o permanece en estado latente como episoma intranuclear (Sawtell NM 1992), en ese estado es transcripcionalmente silencioso. Los que se utilizan como vectores tienen promotores específicos que les permiten funcionar durante el estado de Latencia (Miyatake S et al., 1997 & Steiner I. 1989).

Vectores derivados de Retrovirus

Los Retrovirus poseen un genoma de aproximadamente 9.7 kb, constituido por una cadena de ARN. Se replican mediante la formación de una doble cadena de ADN (provirus) como intermediario. En el ciclo de vida del virus, existe una etapa obligatoria, en la cual la doble cadena de ADN se inserta en el genoma de la célula huésped, merced a las secuencias LTR (Terminales de Larga Repetición), llegando así a formar parte del material genético de la célula que infecta (Rollins SA et al., 1996). A los vectores retrovirales utilizados en TG, se les elimina su capacidad de replicación al retirar del virus las secuencias gag, pol y env que codifican las proteínas del core, las responsables de la síntesis o recombinación de los ácidos nucleicos, es decir, transcriptasa reversa e integrasa y las componentes de la envoltura de la partícula viral, respectivamente (Kim SH et al., 1998 & Saleh M. 1997). Al genoma viral se le incorpora una nueva secuencia génica que contiene el gen terapéutico (Roth JA et al., 1996 & Tait DL et al., 1997). El vector retroviral, sin las secuencias gag, pol y env, se amplifica en una línea celular especial (células empaquetadoras) que contienen en su genoma las secuencias necesarias para ello. El vector conteniendo el gen exógeno infecta a la célula blanco y una vez en el citoplasma, la transcriptasa reversa permite la síntesis de ADN a partir de ARN. El ADN sintetizado se integra al azar en el genoma de la célula infectada y el gen expresará el producto terapéutico (Tait DL et al., 1997).

Vectores derivados de Lentivirus

Los Lentivirus pertenecen al grupo de los retrovirus, muchos de los vectores lentivirales de uso para TG se basan en el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Los vectores HIV pueden permitir insertos de grandes genes e inducir su expresión por mayor tiempo porque se integran en el cromosoma. A diferencia de los retrovirus convencionales, los lentivirus también pueden infectar de forma eficiente a células que no se están dividiendo y por lo tanto se pueden utilizar para la expresión del transgen en las neuronas, de hecho, ya se han logrado introducir exitosamente construcciones con intrones en lentivirus (Herrera E.M et al., 2012).

Consecuencias

Existen, sin embargo, importantes limitaciones en el empleo de virus, derivados de la transferencia y la expresión de secuencias virales. En consecuencia, la seguridad en el empleo de los vectores virales constituye una importante preocupación, bien porque puede producirse una transferencia involuntaria del virus nativo patógeno, o bien porque pueda activarse un virus patógeno o un oncogén debido a la posibilidad de recombinación génica al insertarse un gen foráneo en el genoma del huésped (C. L. Ronchera-OMS; J. Mª. González. 2012).