Control biológico de Fusarium Nygamai en sorgo

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Resumen

El sorgo, entre otros cultivos, es de gran importancia para la alimentación del ganado en Uruguay. Las especies fitopatógenas del genero Fusarium, producen grandes pérdidas en los cultivos provocando daños a nivel de raíz, tallo y granos. La resistencia de algunos de estos hongos a los fungicidas ha estimulado la búsqueda de nuevas alternativas para su control. La aplicación de microorganismos a cultivos de importancia económica, constituye una alternativa ecológica que permite la conservación del medio ambiente. El objetivo del presente trabajo consistió en seleccionar y evaluar cepas antagónicas, bajo condiciones de laboratorio, para el control de Fusarium nygamai en sorgo. Para tal propósito se partió del aislamiento, caracterización e identificación de F. nygamai, obteniéndose cepas a partir de raíz, tallo y granos de sorgo infectado. De estas cepas se seleccionaron 2 provenientes del tallo (FnT1 y FnT2), 1 de raíz (FnR) y 1 de granos (FnG). De 19 cepas nativas bacterianas la cepa (B10) presentó el mayor efecto inhibitorio contra las 4 cepas de F. nygamai, que manifestó en el mayor tamaño de los halos de inhibición en cultivos duales. Se determinó la reducción de la velocidad de crecimiento de F. nygamai, al utilizar los cultivos bacterianos autoclavados de las 19 cepas. Las cepas B10 y B18 produjeron una inhibición del crecimiento mayor al 60%. Estas cepas se utilizaron para evaluar la reducción en la producción por F. nygamai de fumonisinas en los granos de sorgo. Estás cepas bacterianas vivas y autoclavadas ejercieron una reducción significativa sobre la producción de fumonisinas por las 4 cepas de F. nygamai entre 74% y 87%. Además, se evaluó el efecto inhibitorio de estas cepas sobre la incidencia de infección, la emergencia y el desarrollo de plantines de sorgo a los 7, 14 y 21 días de incubación. El uso del adherente carboxi-metil-celulosa con que fue peletizado las semillas de sorgo no favoreció el efecto inhibitorio de las bacterias sobre F. nygamai. La aplicación de los cultivos bacterianos y de los autoclavados directamente sobre las semillas de sorgo produjo una reducción, a partir de los 14 días, del 83% y 90%, respectivamente. Estos resultados indican que las cepas bacterianas estudiadas pueden resultar agentes de biocontrol de F. nygamai en sorgo.

Introducción

La necesidad mundial de aumentar de manera sostenible la producción de cereales libre de patógenos para cubrir las necesidades crecientes de alimentos, ha impulsado la búsqueda de variedades con mayor rendimiento y resistencia. El déficit de granos previsto, a partir del 2050, será de 450 millones de toneladas anuales, lo cual equivale a 220 kg/ha per cápita, por lo que se hace necesario crear estrategias para incrementar la producción con altos rendimientos (Pérez, et al., 2010).

El sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) presenta buena adaptabilidad y rendimientos, por lo que se le ha denominado "el cereal del siglo XXI". A nivel mundial, a principio de los años sesenta, se empleaba una gran cantidad de sorgo para la alimentación humana. En la actualidad su utilización es fundamentalmente para el consumo animal siendo la producción mundial en el periodo 2011/12 de 62,76 millones de toneladas. Se le ha clasificado como el quinto cereal de mayor importancia en el mundo, después del trigo, el arroz, el maíz y la avena aportando el 3% de la producción total (Dragún et al., 2010).

El sorgo es un cereal de verano originario del continente africano y asiático, y presenta una distribución mundial que se extiende hacia las regiones áridas y semiáridas de los trópicos y subtrópicos (Doggett, 1998). En la figura 1, se muestran las principales zonas del mundo donde se cultiva.

Debido fundamentalmente a las características del sistema radicular, enrollamiento de las hojas, cubierta cerosa gruesa, estomas pequeños y numerosos, el sorgo posee una mejor regulación de la perdida de agua por transpiración que el maíz. Además, de su tendencia a reanudar el crecimiento cuando se reduce el stress hídrico, la planta de sorgo produce nuevas cañas si la sequía no ha sido prolongada (Irigoyen & Perrachon, 2007).

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Fig. 1. Principales zonas del mundo donde se cultiva el sorgo

Tomado de: http://www.monografías.com/trabajos/sorgo/sorgo.shtml.

En Uruguay, entre los cultivos de secano, el sorgo es relativamente nuevo como cultivo granífero (Figura 2). El 95% se destina para la alimentación animal (aves, vacunos de carne y leche, suinos), donde el principal rubro demandante es la producción avícola (carne y huevos).

El rendimiento potencial, ha ido aumentando debido a la implementación de tecnología y al manejo del cultivo (56%), preparación de suelo y material genético (44%). Es el cultivo que más responde a la evolución tecnológica.

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Fuente: propia

Fig. 2. Cultivo de sorgo granífero

El área de sorgo granífero sembrada supera las 65 000 ha por año (Methol, 2011). Dado que es una especie de origen tropical, el sorgo requiere temperaturas altas para su desarrollo normal, siendo por lo tanto, sensible a las bajas temperaturas (Mari, 2003).

De acuerdo con las buenas perspectivas del mercado (Figura 3), se prevé un aumento del área para la siembra como también un aumento del volumen de semilla importada. En la tabla 1, se presentan las importaciones de semillas de sorgo y maíz en el período 2002-2011, la estimación del área que potencialmente puede ser sembrada y el área sembrada con destino a grano seco de acuerdo con las estadísticas de la Dirección de Estadísticas Agropecuarias (DIEA).

Tabla 1. Importaciones de semilla, potencial de siembra y área sembrada estimada por DIEA de maíz y sorgo.

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Fuente: Methol (2011)

Otros de los beneficios de este cultivo es su utilización potencial y real en la producción de biocombustibles (Tabla 2). Tanto el maíz como el sorgo poseen una tasa de conversión a etanol 400 litros por tonelada, mientras que de la caña de azúcar se pueden extraer 75 litros por tonelada. A pesar de ello, los rendimientos de caña de azúcar por hectárea son de 65 toneladas y la convierten por lo tanto en el cultivo más productivo (Schvarzer & Tavosnanska, 2007).

Tabla 2. Rendimiento de etanol por hectárea de cultivos seleccionados.

Cultivo

Rendimiento th/ha

Conversión a etanol Lts/th

Lts etanol/ha

Caña de azúcar

65

75

4.875

Maíz

8

400

3.000

Sorgo

5

400

2.000

Fuente: Schvarzer & Tavosnanska (2007)

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Fig. 3. Principales Departamentos productores de sorgo

Fuente: encuesta agrícola-IDEA, 2009

Fusarium es un género de hongos ubicuos y extremadamente versátiles, usualmente saprofitos del suelo, asociados a materia orgánica en descomposición e insectos (Sapumohotti, 2004), tiene una distribución cosmopolita y se producen en la mayoría de las regiones climáticas del mundo (Burgess, 1981; Nelson, et al., 1983). Sin embargo, muchas especies de este género son parásitos facultativos de numerosos hospederos, en los que se incluyen plantas, humanos y animales (Summerell et al., 2001).

La forma perfecta (teleomorfo) de Fusarium, en las especies que la presentan, pertenecen a los géneros Nectria, Calonectria, Micronectriella y Gibberella (Ascomycetes, Hypocreales) que se caracterizan por la producción de ascosporas en peritecios (Desjardins, 2003; Leslie & Summerell, 2006).

Las especies de Fusarium han sido tradicionalmente definidas por sus caracteres morfológicos. Estas características incluyen la forma y tamaño de los macroconidios, la presencia o ausencia de clamidiosporas, la forma y ontogenia de las microconidios y la pigmentación de la colonia (Llorens et al., 2006; Leslie & Summerell, 2006). Las colonias del genero Fusarium sp. presentan diversos colores (blanco, rosado pálido), aunque en el reverso de la colonia pueden presentar colores rojos, salmón y violeta. Los pigmentos que difunden en el agar suelen variar de color o tono con el pH; (Summerell et al., 2001).

El suelo es el medio para el crecimiento de los cultivos agrícolas, pero también es el hábitat para muchas especies de Fusarium en zonas templadas, regiones tropicales, árticas y alpinas (Burgues, 1981). Estos hongos pueden estar asociados a eventos patológicos que ocasionan daños severos, invadiendo los tejidos a través de aperturas naturales o heridas en cultivos agrícolas de importancia económica como el sorgo, maíz, la caña de azúcar, el trigo y el arroz, causando daños económicos significativos (Nirenberg & O"Donnell, 1998; García & Marting, 2010). Pueden producir pudriciones a nivel de tallo, raíz y granos produciendo pérdidas graves en la producción (Frederiksen & Odvody, 2000; Gallardo-Reyes et al., 2006).

Especies de este género pueden producir micotoxinas bajo condiciones ambientales determinadas como humedad, temperatura y oxígeno (Perrou, 2002). La capacidad toxicogénica es cepa específica. En algunos casos la contaminación con micotoxinas se da principalmente en el campo donde hay condiciones favorables de humedad (Magnoli et al., 1999). Las micotoxinas son metabolitos secundarios de bajo peso molecular producidos por hongos filamentosos, en la etapa final del crecimiento exponencial o al principio de la fase estacionaria. No tienen aparentemente importancia en el crecimiento o en el metabolismo de estos organismos y poseen distinto tipo de toxicidad tanto en humanos como en animales. Su producción puede ocurrir antes o durante la cosecha de los granos, así como también durante el almacenamiento y transporte de los mismos (Bullerman & Bianchini, 2007). Pitt (1996) las define como "metabolitos fúngicos cuya ingestión, inhalación o absorción cutánea reducen la actividad, pueden causar daños en la salud y/o la muerte de animales y humanos". Son compuestos estables, no se destruyen durante la mayor parte de las operaciones de procesamiento de los alimentos, por lo que son contaminantes naturales en materias primas, alimentos para humanos y raciones (Bullerman & Bianchini, 2007; García et al., 2009).

Algunas micotoxinas pueden causar enfermedades autoinmunes, ser teratogénicas, carcinogénicas, mutagénicas, etc. (CAST, 2003). Entre las principales toxinas producidas por especies de Fusarium se encuentran los tricotecenos (deoxinivalenol, Toxina T2, diacetoxiscirpenol), la zearalenona y las fumonisinas (Pan et al., 2009; Pacin et al., 2009; Al-Mughrabi, 2010; Pereira et al., 2010).

Las fumonisinas fueron descriptas por primera vez en 1988 por dos grupos de trabajo de manera independiente. Uno de ellos estaba investigando la causa del cáncer de esófago en humanos en ciertas partes de Sudáfrica (Bezuidenhout et al., 1988), y el otro estaba buscando encontrar la etiología de una de las enfermedades que afectan a los caballos, la ELEM (leucoencefalomalacia). Según Magnoli et al., (1999) se aislaron y caracterizaron las fumonisinas a partir de cultivos de Fusarium moniliforme presentes en maíz Sudáfrica (Bezuidenhout et al., 1988).

Las fumonisinas son producidas por Fusarium verticillioides (sinónimo F. moniliforme Sheldon), Fusarium proliferatum, F. fujikuroi, F. subglutinans, F. anthophilum, F. nygamai y F. napiforme. Fuera del género Fusarium se ha mencionado que Alternaria alternata, produce las fumonisinas FB1, FB2, FB3 (Mirocha et al., 1996; Soriano & Dragacci, 2007).

Producen síntomas neurotóxicos (leucoencefalomelacia), nefrotóxicos, edema pulmonar y cerebral y lesiones cardiacas. Entre los animales, los cerdos y los caballos son los más sensibles a la intoxicación por fumonisinas (Hascheck et al., 2001; Foreman et al., 2004; Giannitti et al., 2011). La información acerca del efecto de la fumonisinas sobre la salud humana es limitada y no concluyente. La evidencia epidemiológica ha vinculado esta micotoxina con el consumo de cereales contaminados y con una alta incidencia de cáncer de esófago en humanos (Marasas et al., 1979; Pitt, 2000). El Centro Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer (IARC), clasificó las fumonisinas como posibles carcinógenos humanos (Grupo 2B) (IARC, 2002). En las Tabla 3 y 4 se muestran los niveles de fumonisinas maximos permitidos para proteger la salud humana y animal a nivel mundial.

Tabla 3. Contenidos máximos permitidos de fumonisinas en cereales para el consumo humano (µg/kg) (Reglamento CE nº 1126/2007)

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Tabla 4. Valores permitidos de fumonisinas en productos destinados a la alimentación animal (mg/kg) (Reglamento CE nº 2006/576).

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Pocos estudios se han realizado sobre la presencia de F. nygamai, como patógeno asociado al cultivo del sorgo granífero y como productor de fumonisinas en Uruguay. Estudios micológicos, realizados por el Laboratorio de Micología de la Facultad de Ciencias-Facultad de Ingeniería de la UdelaR en granos de sorgo dulce y granos de maíz, permitieron poner en evidencia la presencia de especies de Fusarium, con niveles de infección elevados (Fornier et al., 1999, Del Palacio et al 2012). F. nygamai, se caracteriza por la formación de esporodoquios constituidos por macroconidios rectos a ligeramente curvados, de 3 septos, con una célula apical y una célula basal en forma de pie. Los microconidios son aseptados pero ocasionalmente pueden tener un septo, ovales a elípticos, se producen en cadenas relativamente cortas o en falsas cabezas, en monofiálides y polifiálides (Figura 4). Forman clamidosporas de pared lisa a rugosa como estructuras de resistencia y propagación (Burgess & Trimboli, 1986). El estado sexual o teleomorfo es Gibberella fujikuroi (Sawada) y es poco frecuente en la naturaleza (Perrou, 2002).

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Fig. 4. Fusarium nygamai Burgess & Trimboli (1986).

Tomado de: Leslie et al., (2006).

A – B: Macroconidia; C – D: Microconidia; E – F: Microconidia in situ en CLA.

A – D, barra de escala = 25 µm; E – F, barra de escala = 50 µm.

Esta especie fue aislada por primera vez en raíces y granos de sorgo, puede colonizar tejidos aéreos y subterráneos de muchos cultivos, afectando principalmente su raíz (Burgess & Trimboli, 1986; Balmas et al., 2000; Kurmut, et al., 2002). Otros síntomas los producen en el tallo, hojas y granos, afectando el rendimiento en grano e influyendo en el valor nutritivo y palatabilidad de los mismos (Burgess & Trimboli, 1986).

El ciclo de Fusarium nygamai en el cultivo del sorgo

El cultivo de sorgo puede infectarse por esporas F. nygamai provenientes de rastrojo presentes en el suelo y alcanzar las espiguillas. Además el inóculo del suelo puede penetrar por el sistema radicular de la planta e iniciar una infección sistémica, limitando la absorción de agua y nutrientes. Se producen así los primeros síntomas de marchitamiento y necrosis. Por otro lado, el daño generado por la actividad de insectos en tallo, hojas y panoja favorecen la entrada de esporas, afectando su calidad y rendimiento.

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Fig. 5. Ciclo de infección de Fusarium nygamai en sorgo

El control biológico, en un sentido amplio y según la definición de Baker & Cook (1974) consiste en la reducción de la densidad del inóculo o de las actividades de un patógeno productor de enfermedad, por uno o más organismos. Se conocen numerosos grupos de bacterias de Actinomicetales, Pseudomonas, Bacillus y de hongos como Trichoderma y Gliocladium con capacidad antagónica frente a otros microorganismos patógenos. Estos antagonistas actúan de diferente forma sea por antibiosis, competencia o hiperparasitismo. En el caso de las bacterias muchas pertenecen al género Bacillus y su acción principal está dada por la producción de metabolitos secundarios (Silo et al., 1994; Berg & Hallmann 2006). El rápido crecimiento que muestran estas bacterias en cultivo líquido, la formación de endosporas resistentes al calor y la desecación y la producción de metabolitos termostables son características que permiten considerar a estos microorganismos como potenciales agentes de control biológico (Shoda, 2000; Alabouvette et al., 2006; Kinsella et al., 2009).

Las investigaciones desarrolladas acerca del control biológico de patógenos en el cultivo del sorgo son muy escasas constituyendo un desafío encontrar alternativas efectivas y viables para el agricultor. El hecho que el hongo tenga como hábitat natural al suelo, hace que cualquier producto químico que se aplique sea insuficiente para reducir la población (Albarracín, 2010). Por ello se ha propuesto aprovechar la actividad antagónica de algunos organismos sobre F. nygamai.

Materiales y métodos

4.1- Aislamiento e identificación de Fusarium nygamai

Para el aislamiento de las cepas de F. nygamai se seleccionaron granos de sorgo de forma aleatoria y pequeños trozos de raíces y tallos con síntomas de infección de aproximadamente 1 cm de longitud. A dichas muestras se les realizó una desinfección superficial con NaClO al 4% durante un minuto y por último se hicieron tres lavados con agua destilada estéril. El material vegetal fue secado con papel absorbente estéril y finalmente sembrado en cajas de Petri conteniendo medio de cultivo de agar-papa-glucosa (APG) (Agar 20 g; Dextrosa 20 g; Papas blancas 250 g; 1000 ml agua destilada), e incubado a una temperatura de 25 ºC bajo ciclos de 12h12h de luz blanca y luz negra durante 7-10 días. Pasado este tiempo, las colonias desarrolladas se observaron bajo microscopio estereoscópico (40x).

Las colonias pertenecientes al género Fusarium, se sembraron en cajas de Petri conteniendo medio de cultivo agar-hojas de clavel 2% (AHC) (Agar 20gr; 1000 ml agua destilada; hojas de clavel esterilizadas superficialmente) y APG, incubándose a una temperatura de 25 °C bajo ciclos de 12h12h de luz blanca y luz negra durante una semana, para su posterior identificación. Una vez obtenidos los distintos aislamientos, la identificación de las cepas de F. nygamai se realizó observando las características macro y micromorfológicas según la metodología propuesta por Nelson et al., (1983); Burgess & Trimboli (1986).

Las cepas de F. nygamai identificadas fueron conservadas en glicerol al 10% a -80 ºC, e incorporadas a la Micoteca del Laboratorio de Micología de la Facultad de Ciencias-Facultad de Ingeniería.

4.2- Cultivos monospóricos

Se realizaron cultivos monospóricos a todas las cepas de F. nygamai aisladas. Para ello se tomo una pequeña cantidad de propagulos fúngicos de las colonias desarrolladas en AHC y se realizo una suspensión en 10 ml de agua destilada estéril. Esta suspensión se homogeneizó y transfirió a cajas de Petri conteniendo AHC donde se diseminó por rotación y se descartó el líquido sobrante. Las placas fueron incubadas de forma inclinada en cámara oscura, a

25 ºC durante 24 horas para permitir la germinación de las esporas. Luego las esporas germinadas bajo microscopio estereoscópico (10X) y con ayuda de una aguja histológica estéril fueron transferida a cajas de Petri conteniendo medio de cultivo APG, incubándose a 25 ºC bajo ciclos de 12h12h de luz blanca y luz negra durante 7-10 días.

4.3- Selección de antagonistas bacterianos de F. nygamai

4.3.1- Cepas de F. nygamai utilizadas

Se seleccionaron para los ensayos in vitro 4 cepas de F. nygamai obtenidas del material vegetal estudiado: 2 provenientes del tallo (FnT1 y FnT2), 1 de raíz (FnR) y 1 de granos (FnG).

4.3.2- Cepas bacterianas utilizadas

Se utilizaron para los ensayos in vitro 19 cepas bacterianas obtenidas de diferentes sustratos vegetales y depositadas en la colección del Laboratorio de Micología. Los cultivos se mantienen conservados en glicerol al 10% a -80 ºC.

4.3.3 Efecto de las cepas bacterianas sobre micelio de F. nygamai

La actividad antagónica se determinó mediante la observación de un halo de inhibición del crecimiento micelial adyacente a la cepa bacteriana como resultado de la actividad de metabolitos bacterianos extracelulares que difunden en el agar. Para ello se inocularon discos de 7 mm de diámetro de micelio del hongo en el centro de cajas de Petri conteniendo medio de cultivo APG y en puntos equidistantes se inocularon puntualmente diferentes cepas bacterianas. Las cajas se incubaron a 25 ºC bajo ciclos de 12h12h de luz blanca y luz negra. La medición de los halos de inhibición producidos se realizó diariamente durante 8 días. Los ensayos se realizaron por duplicado.

4.4 Estudio del efecto inhibitorio de los cultivos bacterianos autoclavados sobre la velocidad de crecimiento del micelio de F. nygamai

Se evaluó el efecto sobre la velocidad de crecimiento de F. nygamai en presencia de cada cepa bacteriana. Para ello se inocularon 3 anzadas de las bacterias que presentaron efecto antagónico en Erlenmeyers de 250 ml conteniendo 50 ml de caldo-papa-dextrosa (PDB) (Dextrosa 20g; Papas blancas 250g; 1000 ml de agua destilada) y se incubaron en un agitador mecánico orbital (marca New Brunswick Scientific), a una temperatura de 28 ºC y 180 rpm durante 5 días. Posteriormente cada cultivo bacteriano se autoclavó para evaluar el efecto de la termoestabilidad de los metabolitos. Para ello, el caldo bacteriano se esterilizó en autoclave (marca P-Selecta) a una temperatura de 121 ºC, 1 atm durante 15 minutos.

Se virtió una alícuota de 500 &µL de cada una de las 19 cepas directamente en las cajas de Petri con medio de cultivo APG solidificado y se dispersó circularmente con una asa de vidrio esterilizada, sobre el cual se inoculó un disco de 7 mm de diámetro con micelio de las cepas de F. nygamai y se incubó a 25 ºC bajo ciclos de 12h12h de luz blanca y luz negra. El control consistió en cajas de Petri con medio de cultivo APG sembradas solo con F. nygamai. Los ensayos se realizaron por triplicado. En todos los casos el diámetro de crecimiento se midió diariamente, en dos direcciones en ángulo recto. La velocidad de crecimiento (mmh-1) se calculó por regresión lineal del radio de la colonia en función del tiempo, para cada aislamiento de F. nygamai en cada una de las condiciones evaluadas.

4.5- Estudio del efecto de cada antagonista en la producción de fumonisinas por F. nygamai

Para evaluar el efecto de los antagonistas bacterianos seleccionados sobre la producción de fumonisinas, se depositaron 20 g de granos de sorgo de la variedad "Milo" en bolsas plásticas y se esterilizaron en autoclave. Finalmente se colocaron los granos en Erlenmeyers de 250 ml conteniendo 50 ml de medio PDB inoculado con 3 anzadas de cada antagonista bacteriano y en Erlenmeyers conteniendo 50 ml de medio PDB con los antagonistas bacterianos autoclavados. Estos se incubaron en un agitador mecánico orbital, a 28 ºC, 120 rpm durante 30 minutos. Pasado este tiempo, los granos fueron transferidos a cajas de Petri sobre los cuales se colocaron 4 discos de 7 mm de diámetro con micelio de cada una de las cepas de F. nygamai. Las cajas de Petri fueron incubados en cámara húmeda y oscura a una temperatura de 25

ºC durante 21 días. Los ensayos se realizaron por triplicado. Finalmente los granos fueron molidos y conservados a -20 ºC hasta el momento de su análisis.

4.5.1- Determinación de la producción de fumonisinas

La detección y cuantificación de fumonisinas, se realizó mediante inmunoensayo enzimático competitivo (ELISA) de uso comercial, Marca R-Biopharm (RIDASCREENR FAST Fumonisin), con un límite de detección de 222 &µg/kg.

Las muestras de sorgo molidas (20 g) antes descritas se mezclaron con 100 ml de metanol al 70% durante 2 minutos y se filtraron a través de papel de filtro Whatman Nº 1. Cada extracto obtenido, se diluyó 1:14 con agua destilada y se sembraron 50 µL de este filtrado diluido y de cada uno de los estándares de reacción en pocillos para ELISA. Los estándares corresponden a concentraciones de fumonisinas de 0 &µg/kg, 222 &µg/kg, 666 &µg/kg, 2 &µg/kg y 6 &µg/kg. Luego se agregó a cada posillo 50 µL del conjugado enzima-fumonisina y 50 µl del anticuerpo anti-fumonisina. Se incubaron los pocillos a temperatura ambiente por 10 minutos y luego se descartó el contenido de los pocillos y se le realizaron 3 lavados con una solución tampón fosfato 10 mM (pH 7,4) - Tween 20 al 0,05%. Se agregó a cada uno de los pocillos 100 µL de sustrato cromógeno y se incubaron nuevamente las muestras a temperatura ambiente por 3 minutos, en condiciones de oscuridad. Finalizado este tiempo de incubación se detuvo la reacción mediante el agregado de 100 µL de una solución de H2SO4 1 N a cada pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro para ELISA (Microwell EL 301). Para el análisis de los resultados se utilizó el sofware RIDASOFT Win®, donde se ingresaron las absorbancias dadas por el espectrofotómetro, y se obtuvo una curva de calibración realizada con los estándares. A partir de la curva de calibración se determinaron los niveles de fumonisinas presentes en cada muestra.

4.6- Bioensayos en semillas de sorgo peleteadas con los antagonistas bacterianos para evaluar la actividad antagónica contra la infección por Fusarium nygamai

Para los bioensayos de sorgo, se utilizaron los antagonistas bacterianos que presentaron mayor capacidad antagónica frente a las cepas de F. nygamai. Para ello se utilizaron semillas de la variedad "Milo" estilizados superficialmente con una solución de alcohol al 80% durante 1 minuto, NaClO al 4% durante 2 minutos, y por ultimo tres lavados de 1 minuto con agua destilada estéril. Estas semillas se sembraron en cajas de Petri con medio fresco de APG durante 7 días a 25 ºC para verificar su esterilidad.

Las semillas de sorgo estériles se transfirieron a Erlenmeyers conteniendo 100 ml del cultivo bacteriano vivo y autoclavado de las cepas antagónicas y 1,5 g de carboximetil-celulosa (CMC) (15 g/L). Estos fueron incubados a 28 ºC en un agitador orbital a 120 rpm durante 30 minutos, para permitir que las células bacterianas se adhieran a las semillas de sorgo. Pasado este tiempo, las semillas fueron sembradas en tubos de ensayos de 25 x 150 mm (una semilla por tubo) conteniendo como soporte 5 ml de agar-agua al 2% (Agar 20 g; 1000 ml de agua destilada) y se inocularon con 2 discos de 7 mm de diámetro de micelio de F. nygamai al momento y a las 24 horas. Los tubos se incubaron a 25 ºC bajo ciclos de 12h12h de luz blanca y luz negra durante 21 días. Los ensayos se realizaron por triplicado y se utilizaron 10 semillas por tratamiento. A los 7, 14 y 21 días de incubación se evaluó, la emergencia de las plántulas, el desarrollo del sistema radicular y la incidencia de infección. La incidencia se determinó como el número de plántulas con síntomas sobre el total de plántulas evaluadas.

4.7- Bioensayos en semillas de sorgo para evaluar la actividad antagónica contra la infección por F. nygamai sin adherente (CMC)

Para ello semillas de sorgo estériles y germinadas se sembraron en tubos de vidrio de 25 x 150 mm (una semilla por tubo) conteniendo como soporte 5 ml de agar-agua al 2%, y se inocularon con 100 µL de los cultivos bacterianos vivos y autoclavados, luego se inocularon los tubos con 2 discos de 7 mm de diámetro de micelio de F. nygamai al momento y a las 24 horas. Los tubos se incubaron a 25 ºC bajo ciclos de 12h12h de luz blanca y luz negra durante 21 días. Los ensayos se realizaron por triplicado y se utilizaron 10 semillas por tratamiento. Se evaluó a los 7, 14 y 21 días de incubación, la emergencia de las plántulas, el desarrollo del sistema radicular y la incidencia de infección. La incidencia se determinó como el número de plántulas con síntomas sobre el total de plántulas evaluadas.

4.8- Análisis estadístico

Los resultados de las velocidades de crecimiento y la cuantificación de fumonisinas en los diferentes casos, se analizaron mediante análisis de varianza. Los promedios fueron comparados usando el test de Fisher LSD ó de Tukey para determinar si existió diferencias significativas entre los controles y los tratamientos.

Hipótesis

Metabolitos bacterianos pueden reducir el crecimiento micelial y la producción de fumonisinas por Fusarium nygamai.

Objetivos

3.1- Objetivo general

El principal objetivo de este trabajo fue seleccionar y evaluar la efectividad de antagonistas bacterianos bajo condiciones de laboratorio, para el control de Fusarium nygamai en sorgo granífero.

3.2- Objetivos específicos

Discusión

6.1- Aislamiento e identificación de Fusarium nygamai

Los aislamientos de Fusarium nygamai provenientes de distintos partes de la planta de sorgo granífero corroboran la existencia de esta especie toxicogénica en el país. Nuestros resultados confirman lo descrito por otros investigadores acerca de la presencia de este hongo en sorgo (Burgess et al., 1989; Klaasen & Nelson 1998). Su presencia ya fue detectada en varios países siendo el sorgo el cultivo principal (Sapumohotti, 2004).

6.2- Efecto inhibitorio de las cepas bacterianas

Debido a que se trata de un hongo toxicogénico ha surgido la necesidad de investigar nuevos agentes para su control (López et al., 2004; Yassin et al., 2010). A partir de los resultados obtenidos con cepas bacterianas nativas in vitro, se demostró que el crecimiento de F. nygamai puede ser controlado. Si bien no se encontraron antecedentes en la literatura sobre el antagonismo contra F. nygamai, estudios realizados previamente por Amézquita et al., (2010) mostraron que aislamientos de bacterias de sustratos naturales redujeron el crecimiento micelial in vitro de Fusarium oxysporum.

El efecto de metabolitos secundarios liberados al medio por las bacterias fue evidente por los halos de inhibición del crecimiento de F. nygamai. El micelio mostró un engrosamiento de las paredes y vacuolización del citoplasma como resultado de la antibiosis. Estas modificaciones en las hifas de F. nygamai concuerdan con los resultados de Chan et al., (2003) y Basurto-Cadena et al., (2010) quienes observaron los mismos cambios en las hifas de otras especies de Fusarium tales como F. verticilloides, F. solani y F. oxysporum. Es importante señalar el efecto sobre F. verticilioides porque pertenece a la misma sección (Liseola) que F. nygamai y ambos son importantes productores de fumonisinas.

6.3- Estudio del efecto inhibitorio de los cultivos bacterianos autoclavados

Los metabolitos producidos por las bacterias algunos son termoestables, ya que al menos 13 cultivos bacterianos autoclavados inhibieron el crecimiento micelial. Estos datos concuerdan con los obtenidos por Kupper et al., (2003) quienes encontraron una disminución en la velocidad de crecimiento de diferentes hongos fitopatógenos con metabolitos termoestables producidos por Bacillus subtilis. Varios autores han demostrado que bacterias del genero Bacillus producen un grupo de metabolitos termoestables descritos como lipopéptidos cíclicos de la clase Iturin que son potentes agentes fungicidas debido a la interacción con las membranas fúngicas (Gueldner et al., 1988). Mas aun en el año 2007 se registró en España una patente sobre la efectividad de metabolitos termoestables para uso como agentes de control biológico de hongos.

6.4- Estudio del efecto de cada antagonista en la producción de fumonisinas por F. nygamai

Los resultados obtenidos indican que los antagonistas bacterianos (B10 y B18) vivos y autoclavados podrían utilizarse como agentes de biocontrol por la habilidad de inhibir la producción de fumonisinas en granos de sorgo. Cavaglieri et al., (2005) y Pereira et al., (2010) encontraron resultados similares en cuanto a la reducción de la producción de fumonisinas por F. verticillioide debido a la producción de metabolitos secundarios producidos por cepas de Bacillus. Una reducción en la contaminación con fumonisinas también se encontró al utilizar Pseudomonas fluorescens en semillas de maíz (Nayaka et al. 2009).

6.5- Bioensayos en semillas de sorgo peleteadas con los antagonistas bacterianos contra F. nygamai

En este estudio se muestra que las semillas peletizadas con CMC no mejoran el comportamiento de los antagonistas frente a la infección por F. nygamai. Si bien la adherencia parecería ser importante a los efectos de preservar los antagonistas sobre las semillas, en este caso no produjeron resultados significativamente positivos. De todas formas estos resultados constituyen un dato interesante, puesto que la CMC esta descrito como un importante adherente derivado de la celulosa. Contrariamente a lo observado en este trabajo, Nayaka et al. (2009) y Egamberdiyeva (2007), inocularon bacterias con CMC en cultivos de maíz provocando incrementos en el largo de la raíz, hecho que contribuiría a una mayor absorción de nutrientes del suelo. Esto hace pensar que algunos adherentes comerciales a base de celulosa pueden aumentar o disminuir la emergencia de las plántulas.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos se sugiere optimizar la técnica de peletizado en semillas de sorgo con los antagonistas bacterianos.

6.6- Bioensayos en semillas de sorgo inoculados directamente con los caldos bacterianos vivos y autoclavados contra F. nygamai sin adherente (CMC)

Al estudiar el efecto antagónico que las cepas B10 y B18 podrían tener sobre F. nygamai, se pudo comprobar que la incidencia de la infección fue reducida en más del 83% con la cepa B18 viva. Otros trabajos de investigación han señalado que ciertas bacterias del género Bacillus inoculadas en forma simultánea promueven la reducción de la severidad de la enfermedad y la incidencia de algunas especies de Fusarium en más del 50% de los casos (Tschen et al., 1985; Pusey, 1989; Yang, 1992).

Estos resultados fueron aún mayores cuando se utilizaron los cultivos bacterianos autoclavados e inoculados con F. nygamai 24 horas después, alcanzándose valores de reducción de la infección entre 83 y 100%. Resultados similares a los obtenidos en este trabajo han sido reportados previamente por Khan & Fiona, (2009) quienes demostraron que la aplicación de agentes biocontroladores 24 horas antes de inocularse F. culmorun en semillas reducen los síntomas de infección. Por su parte, Baro et al., (2008) informaron que con una incubación previa de 24 horas con Trichoderma lignorum resultaba una inhibición completa del crecimiento del patógeno F. oxysporum en cultivos duales en cajas de Petri.

La efectividad de las bacterias vivas y autoclavadas aplicadas sobre las semillas germinadas de sorgo presentó un importante control de los daños provocados por F. nygamai. Este hecho junto con la significativa reducción de la producción de fumonisinas son resultados que hacen muy promisorio el uso de estas cepas bacterianas nativas.

Resultados

5.1- Aislamiento e identificación de F. nygamai

Se obtuvieron 11 cepas de F. nygamai a partir de raíz (3), tallo (5) y granos (3) de sorgo. De estas cepas se seleccionaron 2 provenientes del tallo (FnT1 y FnT2), 1 de raíz (FnR) y 1 de granos (FnG) (Figura 6a, b, c y d).

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Fig. 6. Características macro y micromorfológicas de F. nygamai: (A= Cepas de

F. nygamai, B= Pigmentos difundidos en el medio APG, C= Micelio aéreo,

D= Clamidiosporas)

5.2- Efecto inhibitorio de las cepas bacterianas

De las 19 cepas bacterianas utilizadas 7 presentaron inhibición del crecimiento de las cepas de F. nygamai (Tabla 5).

Los valores muestran que la cepa B10 fue la más eficiente por inhibir en mayor grado al micelio de las 4 cepas de F. nygamai evaluadas (Figura 7).

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Fig. 7. Halos de inhibición del crecimiento micelial de cepas de F. nygamai producidos por las bacterias antagonistas. A. FnT1 vs B17, B2 y B10. B. FnT2 vs B17, B2 y B10.

C. FnR vs B17, B2 y B10. D. FnG vs B17, B2 y B10. Las figuras de la izquierda corresponden al anverso y las de la derecha al reverso.

Las observaciones microscópicas de las zonas de interacción entre antagonista bacteriano y F. nygamai, permitieron determinar que algunas cepas bacterianas producen engrosamientos de la pared hifal y/o vacuolización del citoplasma, explicando en parte el efecto antagónico observado (Figura 8).

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Fig. 8. Observación microscópica del micelio de F. nygamai de la zona de interacción con las bacterias antagonistas. (A- engrosamiento de las paredes de las hifas en la interfase, B- vacuolización del citoplasma y C- micelio normal).

5.3- Efecto inhibitorio de los cultivos bacterianos autoclavados

En la figura 9 se muestran los porcentajes de inhibición de la velocidad de crecimiento de F. nygamai que presentaron diferencias significativas en presencia de 13 cepas bacterianas respecto al control con F .nygamai solo (Fisher LSD, p=0.05).

De los 19 cultivos bacterianos autoclavados probados, 13 mantuvieron un efecto inhibitorio sobre la velocidad de crecimiento de los 4 aislamientos de F. nygamai. Los metabolitos retienen su actividad después del autoclavado reflejando que son termoestables.

Se observó que los cultivos bacterianos autoclavados que presentaron la mayor inhibición en la velocidad de crecimiento de F. nygamai fueron las cepas B6 (47%), B10 (69 %) y B18 (60%).

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Fig. 9. Porcentajes de inhibición de la velocidad de crecimiento de F. nygamai.

5.4- Estudio del efecto de cada antagonista en la producción de fumonisinas por F. nygamai

Las cepas antagónicas seleccionadas ejercen un efecto inhibitorio in vitro sobre la producción de fumonisinas por las 4 cepas de F. nygamai (Tabla 6).

En presencia de la cepa bacteriana B10 viva y autoclavada se observó una reducción de la producción de fumonisinas en grano que varió del 74% al 83.8% con respecto al control (p<0,05).

Sin embargo, en presencia de la cepa B18v hay una leve reducción del 17.2% y con el cultivo bacteriano autoclavado se observa una importante reducción en la producción de este metabolito tóxico (87.2%), aun mayor que la presentada por la cepa B10t, resultados que alcanzaron significancia estadística al ser comparados con el control de F. nygamai.

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5.5- Bioensayos en semillas de sorgo peleteadas con los antagonistas bacterianos contra la infección por Fusarium nygamai

De todas las cepas bacterianas con resultados significativos en la inhibición de la velocidad de crecimiento, se seleccionaron las B10 y B18 que mostraron un mayor efecto inhibitorio en la cepa de F. nygamai aislada de raíz (FnR). Se eligió esta cepa ya que la infección por F. nygamai generalmente se produce a través de la raíz de la planta.