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La observación de microorganismos



Breve introducción Breve sinopsis sobre la observación de los microorganismos, así como un recorrido sobre la preparación previa y las diferentes tinciones que nos facilitan la observación

La observación de microorganismos: fines perseguidos y métodos empleados

Gracias a la observación de los microorganismos vivos podemos observar y estudiar su movilidad, su morfología e incluso algunas de sus estructuras, sin olvidar, la observación de huevos y quistes de algunos parásitos, importantísimos en el análisis microbiológico.

Para efectuar esta observación microbiológica, podemos emplear directamente los productos patológicos o bien acudimos a los cultivos nacientes de medios de cultivo sólidos o líquidos. Los métodos que se emplean en la observación de estos microorganismos son los exámenes en fresco, en el que incluimos las preparaciones húmedas, la gota pendiente y el examen en fresco de nombre "nigrosina", y los colorantes vitales en los que teñimos las células gracias a los colorantes muy bien diluidos.

Pero, cuáles son los pasos o el protocolo de preparación a seguir en las preparaciones húmedas?

Para las preparaciones con material patológico líquido o medio de cultivo líquido se tomará una gota, se depositará sobre un portaobjetos, se cubrirá evidentemente con un cubre y se llevará propiamente dicho la observación al microscopio con el objetivo de inmersión y luz exigua; mientras que para las preparaciones con material patológico sólido o medio de cultivo sólido se coloca sobre el porta una gota de agua destilada estéril, se cargará sobre la misma el material a reconocer con el asa estéril, lo cubrimos con el cubre y procederemos a la observación propiamente dicha al microscopio con el objetivo de inmersión y, eso si, utilizando una luz digamos que exigua.

En tanto en cuanto a los pasos que se dispensan en el llamado método de gota pendiente, se necesitará un porta un porta excavado y un cubre, para luego depositar el material observante en el mismo y colocar el por excavado sobre el cubre, llevando a cabo un volteo al porta, y finalmente se procede propiamente dicho a la observación de este método en el que sobre todo se presta atención a la movilidad del microorganismo; eso si, sin olvidar algo tan importante como la utilización del objetivo de inmersión y el uso de una luz tenue.

En el examen en fresco con tinta china o nigrosina, utilizada en la observación de las crytococcus y sobre todo del líquido cefalorraquídeo (LCR), se procede a plantar sobre un porta una gota de dicha tinta y en ella se le carga la muestra patológica para luego realizar un frotis y comenzar su observación en el microscopio. Por último, en las coloraciones vitales, empleada en la observación de los mínimos pormenores de la estructura celular, se vale de colorantes muy diluidos (1/1000; 1/10.000), por lo que jamás se empleará en este proceder los colorantes puros.

El que más empleamos es la correcta dilución del azul de metileno, para tomar luego una gota de la misma y colocarlo sobre el porta y sobre la misma añadir una gota del medio de cultivo líquido, a no ser que se opte por la solución con la muestra sólida tomada de una placa de cultivo.

Efectuado dichos pasos, se procede al empleo de un cubre sobre la mixtura realizada y así llevarla a observación al microscopio con el empleo del objetivo de inmersión. Igualmente, algunos laboratoristas optan por la añadidura del colorante una vez ya colocado el cubre, por medio de una pipeta que suelta por capilaridad la empleada carga tintosa.

Sobre las preparaciones fijadas y teñidas en el proceso analítico-microbiológico

El objetivo de las preparaciones tanto fijadas como teñidas es la de observar la morfología, la mutualidad microbiana, así como estructuras concretas de dichos microorganismos. Su preparación parte siempre de forma directa a partir bien de la muestra patológica o de los medios de cultivo sólidos o líquidos por el que logramos el contenido microbiano a observar.

Asimismo, podemos clasificar las preparaciones de simples, diferenciales y estructurales, según se utilice respectivamente un único colorante, el empleo de Gram y del ácido alcohol resistente, o el distingo de cápsulas, inclusiones, flagelos y esporas.

Las fases que se siguen en una tinción microbiológica es el frotis, en el que se extienden el material patológico,bien obtenido de forma directa por una muestra o por cultivo; el secado al aire y evitando siempre la sobrecarga de material microbiológico tomado a fin de su presto secado y desprendimiento del mismo en el lavado; la fijación por el método del calor o de la consiguiente inmersión del porta con el frotis efectuado en alcohol; la coloración propiamente dicha en la que se utiliza colorantes básicos; el lavado a fin de eliminar el colorante sobrante y que no ha agarrado sobre las bacterias; y por ultimo el secado y observación propiamente dicha al microscopio y siempre como ya sabemos utilizando el objetivo de inmersión.

Los tipos de colorantes que empleamos en el laboratorio de microbiología depende claramente de su procedencia y de sus características químicas, de este modo, en las primeras observamos los tipos naturales y sintéticos, mientras que en las segundas observamos los colorantes ácidos, de tipo pícrico, los básicos, del tipo azul de metileno, cristal violeta, safranina, fucsina y demás, y los neutros, del tipo giemsa que permite el claro distingo al microscopio del núcleo celular, así como de los cromosomas en la mitosis e incluso en ciertos procesos el mismo ADN mitocondrial, tal como queda reflejado por numerosos autores.

Pero, qué son los colorantes en sí? A qué nos referimos con colorante? Los colorantes son sales bien combinados por un ión positivo y otro negativo, uno de los cuales subsiste coloreado y al que llamamos cromóforo y cuyo ión es positivo en los colorantes básicos, mientras que claramente es negativo en los colorantes ácidos.

Las bacterias repelen los colorantes ácidos ya que suelen tener un pH ácido, sin embargo tienen tendencia por los colorantes básicos.

Sobre las tinciones empleadas en los laboratorios de microbiología

En la utilización de la tinción simple se emplea un solo colorante, que podrá ser, como ya es bien conocido por el laboratorista, cualquiera que sea básico, con un único fin, teñir las estructuras celulares de una misma tonalidad, de este modo podremos observar la morfología y la agrupación microbiana que exhibe las muestras patológicas ligeramente modificadas.

Para tal fin nos sirve los colorantes del tipo azul de metileno de loeffer, fucsina básica, safranina, tinta china o nigrosina, azul de lactofenol y demás.

Asimismo, ha de anotarse que este tipo de tinción toma un cristalizado y un puente como base o sustento para su observación.

En cuanto a las tinciones diferenciales, igualmente sabemos que se emplea el uso de diversos colorantes en combinación a fin de resaltar las estructuras de las células por el distingo que proporcionan las tinturas disímiles empleadas en el uso. Dechados de tinciones diferenciales son la tinción de Gram, la de Ziehl-Neelsen, la tinción ácido alcohol resistente o las tinciones estructurales.

En la tinción de Gram se nos presta la observación de la morfología y agrupación microbiana, sin olvidar como esta claro la diferenciación o distingo que lleva a lugar entre las bacterias Gram+ y Gram-. Por supuesto que entra en juego apreciaciones tales como que la muestra sea reciente, y más si cabe cuando se trata de una muestra procedente de un cultivo en la que la importancia de la fase de crecimiento exponencial es crucial, de lo contrario, en caso de ser antiguas las bacterias Gram+ nos facturaría erróneamente mostrándose como Gram-.

Los colorantes que enlosa esta prueba son uno primario y otro de contraste, y los efectos que conseguimos es el distingo de unas bacterias que no se decoloran y que se ven violeta o morado oscuro y que son las Gram+. Asimismo, se logra el distingo de aquellas que sufren decoloración al tomar el colorante de contraste llamado safranina y que observando un color rojo las identificamos como Gram-.

Algo más a tener en cuenta sobre esta prueba es la toma moderada de inóculo y extenderla bien, de lo contrario no se consiguirá distinguir las Gram+ de las Gram.

Sobre la tinción ácido alcohol resistente, decir que se emplea para teñir e identificar los microorganismos cuyo género es identificado dentro de las micobacterium, tales tuberculosis o leprae, y nocardias. Asmismo, se logra la visualicacion y el distingo que tiene con el resto en cuanto a la pared celular se refiere.

Con esta tinción, las acido alcohol resistentes se tiñeran y visualizarán de color rojo, mientras tanto las no ácido alcohol resistentes lo harán en azul.

Pero que diferencia presenta esta tinción con la de Gram? La respuesta estaría en la mera identificación bacteriana que queremos realizar.

Por ultimo, entre de las tinciones estructurales podríamos encontrar la tinción de cápsulas, importantisimo para observar el factor de virulencia bacteriana, bien por los metodos de Hiss, Anthony o Burry-tinta china; la tinción de corpúsculos metacromáticos por el método de Loeffer; la tinción de flagelos, observando los mismos de las bacterias identificadas como móviles; y la tinción de esporas, observando tanto las esporas en si mismas como que las identificadas como esporuladas y las que no las son.

 

 

 

Autor:

Carlos Rojas Maragoto