Tinciones en microbiología



Objetivos

Realizar diferentes técnicas de tinción para la visualización de estructuras celulares de bacterias.

Adquirir destreza en el montaje y observación de preparados microbiológicos empleando técnicas de tinción simple y diferencial.

Comprender los principios teóricos en los cuales se basan las técnicas de tinción en microbiología.

Comprender la importancia De las Buenas Prácticas de Laboratorio y aplicación de normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología.

Marco teórico

Palabras clave: Tinción, pared celular, Gram, Endosporas.

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado al diagnóstico de enfermedades infecciosas y en la caracterización de nuevas especies. Existe una gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. La tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras que la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el campo de la parasitología.

Existen técnicas de tinción específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los componentes estructurales de los hongos. Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una utilidad fundamental para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología infecciosa (1).

La observación microscópica puede efectuarse mediante el examen en fresco de una suspensión microbiana, lo que permite visualizar microorganismos vivos y reconocer sus movimientos, apreciar sus distintas formas, tamaños y agrupaciones, o mediante un extendido o frotis coloreado, lo que posibilita según la técnica utilizada, diferencias microorganismos, observar su morfología, tamaño y agrupación o la observación de ciertos elementos facultativos como flagelos, capsula ó endosporas (2).

Los colorantes utilizados en microbiología son sales, las cuales tienen un ion cargado positivamente y otro negativamente, de los cuales uno está coloreado. Cuando el ion está coloreado es el cargado negativamente, el colorante se clasifica como aniónico o acido, por ejemplo, el eosinato de sodio, el cual se ioniza como sodio+ y eosinato+. Cuando el ión coloreado es el cargado positivamente, el colorante se clasifica como catiónico o básico, por ejemplo el azul de metileno, el cual se ioniza como cloruro- y azul de metileno+ (3).

Al poner en contacto una célula bacteriana con un colorante ocurre un intercambio de iones entre el colorante y los sitios activos de las superficies o el interior de la célula. Los iones teñidos del colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, así, por ejemplo, el catión azul de metileno+ reemplaza al catión Na+ de las células dándoles color (3).

Según la estructura que el colorante tiñe en la bacteria, las coloraciones se han clasificado en : coloraciones simples, en las que sólo se emplea un colorante para el proceso, ejemplo azul de metileno; coloraciones compuestas y diferenciales, en las cuáles se usa más de un colorante y con la misma coloración , las células se tiñen de manera diferente, ejemplo Gram, Ziehl Neelsen, y coloraciones especiales que permiten la observación de estructuras especiales de la bacteria como endosporas, glicocaliz, capsulas, flagelos (3,4).

En la práctica de Tinciones los estudiantes realizarán técnicas simples como la tinción con azul de metileno y Diferenciales como la Tinción de Gram para diferenciar las bacterias en Gram (+) y Gram (-) Teniendo en cuenta la composición química de su pared celular (peptidoglucano). Una coloración negativa para tinción de cápsulas bacterianas, tinción de Ziehl Neelsen para identificación de bacterias acido alcohol resistente y la tinción de Shaeffer Fulton para la tinción de endosporas (4).

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en bacterias Gram positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias (Figura 1).

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Figura 1. Paredes bacterianas, contenido de peptidoglucano (5)

Metodología

4.1 Procedimiento

Caracterización macroscópica:

A partir de los cultivos de bacterias en medio sólido, describir las características que observa, teniendo en cuenta el color, aspecto y consistencia de las colonias de los microorganismos en el medio de cultivo.

Realización de frotis:

Fijación al Calor:

Tinciones a realizar:

Coloración de azul de metileno (Tinción simple)

Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.

Procedimiento:

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Figura 1. Procedimiento general de fijación al calor y observación.

Coloración de Gram (Tinción Diferencial)

Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram negativas, mientras que en las Gram positivas el colorante queda retenido y las células permanecerán azules-púrpuras. Las células Gram negativas se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse, estas quedan rosadas.

Procedimiento (Figura 2):

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Figura 2. Adición de colorantes de Gram (7)

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Figura 3.a) Bacilos Gram negativos b) Cocos Gram positivos (8)

Coloración con tinta china para cápsula

Se suspenden las bacterias en tinta china, fundamentado en que las partículas de carbón no penetran las cápsulas, las mismas aparecen claras sobre un fondo oscuro (Figura 4).

Procedimiento:

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Figura 4. Tinción Negativa (capsula) (7)

Coloración de Shaeffer-Fulton para endospora (Tinción diferencial)

Las endosporas (figura 5) son formas de resistencia, altamente deshidratadas con una serie de cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difíciles de teñir, excepto si se calienta la preparación para permeabilizarlas; sin embargo, pueden evidenciarse en preparaciones en fresco o con diversas tinciones, pues las esporas aparecen como estructuras refringentes no coloreadas. Las esporas son producidas por Bacillus spp, Clostridium spp, géneros de bacterias Gram Positivas; aunque recientemente han sido descritas en algunas bacterias Gram negativas (4).

Procedimiento:

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Figura 5. Endosporas con tinción Shaeffer Fulton (7)

4.2 Materiales, reactivos y equipos

Tabla 1. Materiales, reactivos y equipos a utilizar

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* Deben ser llevados a la práctica por los estudiantes.

NOTA: Los anteriores materiales están calculados para cada grupo de laboratorio, es decir para realizar la solicitud debe calcularse la cantidad total de acuerdo a los grupos de trabajo que se tengan. Tenga en cuenta que los cálculos son para caja grande de agar.

Preguntas de profundización

Bibliografía

Negroni M. El diagnóstico en clínica estomatológica. 2ª Edición. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana .2007

Escobar de Rico M. Prácticas de laboratorio: fundamentos de microbiología. Santafé de Bogotá. Centro Editorial Javeriano. CEJA.1998.

Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología médica. 26ª Edición. Editorial Mc Graw Hill. 2014. P 11-13

Anexos

Anexo 1. Planilla de resultados de tinciones ( Imprimir 2 hojas)

TINCIÓN: ________________________________________________________

MICROORGANISMO: _____________________________________________

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Objetivo : 100 X

Descripción de los observado:

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TINCIÓN: _________________________________________________________________

MICROORGANISMO: _______________________________________________________

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Objetivo : 100 X

Descripción de los observado:

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Anexo 2. Cuadro complementario

Diga en cada cuadro, que color presentan las células bacterianas en el transcurso de la tinción de Gram.

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Autor:

George Acosta