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Efectos de tres concentraciones distintas de glifosato (roundup) sobre el desarrollo en embriones de cachama blanca



Objetivos

1.1 Objetivos generales

EVALUAR LOS EFECTOS DE TRES CONCENTRACIONES DIFERENTES DE GLIFOSATO (ROUNDUP) SOBRE EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE CACHAMA BLANCA (Piaractus brachypomus).

1.2 Objetivos específicos

Determinar las dosis letales y dosis sub-letales del glifosato frente al desarrollo embrionario de la Cachama Blanca (Piaractus brachypomus) a nivel macroscópico.

Establecer los efectos morfológicos causados por cada una de las dosis durante el desarrollo embrionario de la Cachama Blanca (Piaractus brachypomus).

Justificación del proyecto

La política de erradicación de cultivos ilícitos en Colombia se inició en la década de 1970. El gobierno colombiano a través de un programa nacional de control y erradicación adopta la erradicación química de cultivos por aspersión, basado en trabajos que reportan baja toxicidad en animales y el ser humano  (Eslava, 2007), sin embargo esto ha sido refutado por diferentes autores como Triana (2013), Labrador (2012), Rondon (2010), Eslava (2007), Ardila (2009), entre otros que evidencian modificaciones y daños a nivel estructural y genómico en algunas especies.

La Cachama blanca (Piaractus brachypomus) nativa de las cuencas de los ríos Orinoco y Amazonas, es considerada como la especie de mayor potencial productivo y comercial en la piscicultura. Se cultiva principalmente por su carne, la cual se consume al interior del país y se exporta. Sin embargo, la ausencia de trabajos acerca de las características toxicológicas del Glifosato hace notable la carencia de respaldo argumentado en bioensayos (Rondon 2007). Por lo tanto, se desconoce los efectos letales y subletales del Glifosato sobre el desarrollo embrionario de la Cachama blanca, así como los cambios morfológicos que podrían estarse presentando. La falta de estudios genera un vacío conceptual, que puede traer implicaciones negativas para la especie y para la salud de las personas que se alimenten de su carne.

Esta especie se encuentra en zonas donde los cultivos son frecuentemente asperjados con herbicidas. Las cachamas blancas se exponen desde sus primeros estadios a compuestos xenobióticos pero se desconoce su reacción, sin embargo se ha demostrado efectos deletéreos en organismos terrestres, como acuáticos en estadios adultos. Por lo tanto, el presente estudio se plantea determinar ¿cuáles son los efectos de diferentes concentraciones de Glifosato (Roundup) y surfactante sobre el desarrollo embrionario de la Cachama blanca (Piaractus brachypomus)?.

Planteamiento del problema

Las condiciones naturales presentes en el departamento del Caquetá hacen posible el establecimiento de varios cultivos de plantas y animales. El río Caquetá alberga de manera natural y en cultivos a la Cachama blanca, especie promisoria para la región por su importancia económica en el sector piscícola.  

A partir de la apropiación de políticas extranjeras, ajenas a las dinámicas sociales del país, los cultivos ilícitos han constituido un objetivo de intervención del gobierno colombiano a través de un programa nacional de control y erradicación que se basa en la aspersión química. En el departamento del Caquetá hay presencia de números cultivos ilícitos, los cuales son asperjados con Glifosato. Asimismo, a partir de la década de 1990 se ha observado el aumento progresivo en el uso de herbicidas a nivel de las tareas agrícolas en nuestro país (Burger 2004).

El glifosato puede entrar en ecosistemas acuáticos por lixiviación, escorrentia, aspersión accidental y con la deriva del viento (Eslava et al. 2007). La operación de aspersión se realiza, de acuerdo a lo recomendado por el decreto 1843 de 1991, que plantea 100 metros de distancia de centros poblados y fuentes de agua tipo ríos o lagunas, sin embargo, en diversos estudios se ha encontrado el glifosato hasta 800 m de distancia del sitio asperjado (Eslava et al. 2007), terminando en las fuentes de agua. En el caso de los peces la toxicidad aguda del Roundup es atribuida al componente surfactante, polioxietileno-amina (POEA) (Eslava et al. 2007).

Los adyuvantes de la familia POE-15 (amina de sebo polietoxilado) se han mostrado como muy tóxicos para las células humanas y deben ser regulados como tal. La Cachama blanca es una especie que se expone a este tipo de químicos, lo cual puede generar malformaciones embrionarias, de carácter bio-acumulable las cuales se terminan incorporando en la dieta de la población aledaña, constituyendo una problemática de salud pública.

Marco teórico y antecedentes

4.1 Glifosato (GL):

El glifosato, N-fosfonometil glicina, es un herbicida no selectivo de amplio espectro de carácter ácido con clase II de toxicidad (moderadamente tóxico), según la categorización de la U.S. EPA (Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos); es altamente soluble en agua, con un coeficiente de partición octanol/ agua de -3.2 a 25ºC; El glifosato es el principio activo del producto comercial Roundup (48% de sal ácida isopropilamina de glifosato, 15% de surfactante polioxietilamina (POEA) y 37% de agua, es utilizado en la práctica agrícola como herbicida de uso general para el control de plantas anuales y perennes (Salazar et al, 2011).

La toxicidad (II) evaluada no es exclusivo del GL,  los surfactantes en la mezcla de aspersión, son de naturaleza anfifÌlica y pueden alterar la permeabilidad de las membranas, evidencian una tendencia a acumularse sobre la superficie de las membranas epiteliales y  su tendencia a bioacumularse. Alteran severamente la integridad de los estratos superiores del epitelio branquial de los peces; permitiendo el establecimiento de un imbalance hidroelectrolítico (Eslava et al. 2007).  En otros animales aumenta el consumo de oxígeno, aumenta la actividad de la ATP-asa y disminuye el nivel hepático de citocromo P-450, ocasionando desacople de la fosforilación oxidativa. Pese a ser un compuesto con fósforo, no tiene actividad inhibitoria de las colinesterasas y puede llegar a producir patologías o la muerte.

4.2 Piaractus brachypomus

La cachama blanca del orden Characiformes y la familia Serrasalmidae es endémico de Suramérica, se localiza en la Cuencas del Orinoco y en la Cuenca del Amazonas.  Este ha  sido uno de los peces más importantes en Colombia en las últimas décadas, ocupando el tercer lugar de los peces de consumo más cultivados (Castañeda 2012). El cigoto  de Piaractus comprende desde la fertilización hasta el primer clivaje,  se ha observado que el citoplasma toma una coloración más oscura debido a la segregación citoplasmática., hacia las 0:15 horas post fertilización, ocurre la diferenciación entre el polo animal y vegetal, evidenciado el primero por la mayor concentración de citoplasma (blastodisco) y el segundo por la concentración de vitelo. La segmentación es meroblástica.

4.3 Antecedentes; estudio de plaguicidas en otras especies.

Es evidente la preocupación por los efectos adversos que pueden presentarse en animales, originados por el contacto con formulaciones comerciales de GL y la posible participación en la cadena alimenticia o por el consumo de aguas contaminadas, ya que se ha encontrado GL y su metabolito ácido AMPA, como contaminantes medioambientales, tanto en el suelo como en las riveras.

Diferentes investigaciones sobre exposición al GL y uno de sus principales adyuvantes, el surfactante POEA, han demostrado efectos tóxicos sobre diversos ecosistemas (Labrador et al. 2012). El mecanismo de acción de este herbicida en el hombre y en los animales está vinculado al desacople de la fosforilación oxidativa, los estudios toxicocinéticos en animales de experimentación muestran una absorción de 30% a 36% a nivel del tubo digestivo y una escasa absorción por vía cutánea (Burger, 2004).  Dentro de los efectos de toxicidad se han encontrado cambios en la actividad de enzimas hepáticas en ratas gestantes y sus fetos, alteraciones histopatológicas y bioquímicas en peces y ratas, anormalidades en el desarrollo de anfibios, biotas acuáticas e invertebrados  (Labrador et al. 2012). En el estudio realizado por Brewster et al. (1991) en ratas,se encontraron que aproximadamente el 35- 40 % de la dosis administrada se absorbe en el tracto gastrointestinal y se elimina por la orina y las heces; se ha estudiado también que el GL cambia significativamente el desarrollo de la pubertad de ratas macho Wistar en forma dependiente de la dosis; reduciendo la producción de testosterona y disminuyendo significativamente el espesor del epitelio de los conductos seminíferos y un alto porcentaje de espermas anormales (Salazar et al. 2011)

A nivel embrionario los estudios son más escasos, no obstante se ha reportado que la exposición puede ocasionar una disregulación en la transición del ciclo celular, conjuntamente con el retraso en la progresión del ciclo celular, se ha descrito  también que el GL inhiben la síntesis del ADN durante la fase S. Se ha descrito citotoxicidad y genotoxicidad en células humanas (Rondon, 2007). En larvas de varias especies de anuros  se ha reportado mortalidad tanto en pruebas de laboratorio como en mesocosmos; en otros estudios ha generado alteraciones en el desarrollo de la cresta neural y en el esqueleto cráneofacial, incrementa la duración del periodo larval y reduce la tasa de crecimiento de algunas especies (Triana et al. 2013). Se ha determinado que el  GL per se ocasiona un retraso en la transición de la fase G2 a la fase M del ciclo celular por un fallo en la activación del complejo CDK1/ciclina B en trabajos realizados con embriones de erizos de mar en fase temprana de desarrollo, adicionalmente, para que el GL actué se requiere la presencia conjunta de compuestos surfactantes que permitan el paso a través de la membrana celular (Eslava, 2007). Se acusa al GL en una de las soluciones de producir mortalidad del 100 % de los especímenes a 100 µl/l (equivalente a 48 mg/l de principio activo, adicional a ello ocasionó manifestaciones hematológicas severas (Alvarez, 2012).

El empleo de estos productos y las dosis recomendadas deja abierta la discusión sobre los posibles efectos por su uso indiscriminado en la reproducción y desarrollo de organismos acuáticos, cabe resaltar que dichas alteraciones dependen de la especie u organismo, tipo de compuesto, la concentración de glifosato en agua y el tiempo de exposición (Salazar et al. 2011).

De acuerdo con   Jaime Fernando González, profesor de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia,  la tilapia y el pez cuchillo mostraron una relativa resistencia, sin embargo, el yamú, el bocachico y la cachama blanca presentaron una alta sensibilidad. El sistema nervioso, respiratorio y de antioxidantes ha resultado como las principales afecciones (Colprensa 2015).

Es importante resaltar  que la aplicación constante del herbicida, en los cultivos afecta las poblaciones de peces ya que estas están expuestas todos los días, así sea a bajas concentraciones. En la actualidad  el GL ha sido prohibido para erradicar cultivos ilícitos a partir del mes de octubre, sin embargo, aún es incierto qué pasará con su uso normal en la agricultura.

Diseño metodológico

5.1 Área de estudio:

Departamento del Caquetá está situado al sur del país, en la región amazónica. Tiene una extensión de 88.965 km2 equivalente al 7.8% de la superficie del país, siendo el departamento más grande de Colombia. El departamento se encuentra entre las coordenadas 0° 40´ de latitud y 2° 58´ de latitud norte y los; y 71° 30´ y 76° 15´ de longitud, al oeste de Greenwich. Limita por el norte con los departamentos del Meta y Guaviare; por el sur con el Amazonas y el Putumayo; por el occidente con Cauca y Huila; y por el oriente con Vaupés y Amazonas (Yañez 2009). En el río Caquetá serán tomadas las muestras.

5.2 Especie de estudio

En el presente trabajo se utilizaron 450 embriones de cachama blanca (Piaractus brachypomus) obtenidos del Centro agropecuaria "La Granja" que pertenece al SENA regional Tolima y se encuentra localizado en el municipio de Espinal, El trabajo se realizará en el Laboratorio de Toxicología de la Universidad del Tolima, (Ibagué, Tolima) y en el laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad del Tolima, adscrito a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia.

5.3 Herbicida Empleado

La mezcla de glifosato y surfactante utilizado en este trabajo fue el producto comercial Roundup activo, el cual tiene una concentración de 363 g/L de ácido glifosato de formulación a 20 °C, equivalente a 446 g/L de sal potásica de N-(fosfonometil)-glicina. Las soluciones experimentales del herbicida se prepararon con agua previamente declorada por aireación y se aplicaron en experimentos de laboratorio.

5.4 Obtención de embriones

El procedimiento  corresponde al modelo de (Castillo 2016) donde partiendo con  inició con la inmersión de los  individuos reproductores en una solución anestésica de , de 2-Fenoxietanol (300 ppm, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA), por un lapso  3 a 5 minutos. Una vez perdido el eje de nado, los animales serán extraídos de la anterior solución, posteriormente se  realizara un masaje abdominal en sentido craneocaudal con el fin de extraer los ovocitos y semen, estos se colectaran en un recipiente plástico y tubos de vidrio aforados.

5.5 Procedimiento de laboratorio

Se tomó la metodología de Ucros (2009) y se realizaron adaptaciones en cuanto a la cantidad de tratamientos. Una vez que los ovocitos esten en el laboratorio, se dejarán aclimatar en el refrigerador durante 24 horas en agua reposada y oxigenada, a una temperatura de 15º C. Al cabo de este tiempo se retiraran los ovocitos muertos por causa del transporte, no fertilización y no viabilidad.

El estudio se iniciará después de la aclimatación de los embriones, cuando se encuentren  en el estadio 6 de su desarrollo, es decir blástula temprana, a las 26 de horas de vida. Se utilizaran 9 acuarios de 30 x 20 cm cada uno, y se distribuira la muestra equitativamente, cada acuario contendrá un promedio de 50 embriones de cachama blanca en total. Se tomarán 4 concentraciones diferentes de glifosato en partes por millón y se tendrá un acuario patrón en el que se pondrán los huevos solo en agua para observar un desarrollo normal del embrión (control), para un total de 5 tratamientos y una replica

Se prepara una solución stock inicial agregando 300 gr de glifosato puro por 3 litros de agua; a partir de esta solución se prepararan las diferentes concentraciones, comenzando en 5 ppm, siguiendo en 15 ppm, 20 ppm, 30 ppm y 45 ppm. Para la preparación de cada una de estas concentraciones, se utilizara agua corriente, la cual se dejará reposar durante 24 horas en la misma nevera para que la temperatura fuera la misma.

Cada uno de los acuarios tendrá su propio motor de aire con los cuales se mantendrán constante la oxigenación de estos. Se realizará la limpieza y el recambio del agua y del medio de cada uno de los acuarios cada 24 horas con el fin de mantener las condiciones durante todo el experimento; además los acuarios se taparán con una lámina de vidrio para evitar la evaporación del producto. Cada hora  se tomarán 4 embriones de cada una de las concentraciones y se fijaran en una solución la cual permitirá observar claramente las malformaciones que se están presentando durante cada uno de los estadios de desarrollo. A partir de las concentraciones iniciales se buscará dar con la concentración letal, concentración letal media y las concentraciones sub-letales que tuvieron algún efecto en el desarrollo embrionario de la Cachama Blanca. Estos efectos serán observados en los embriones fijados al estereoscopio.

Para este estudio se utilizará como referencia la tabla de desarrollo realizada por Díaz et al. (2010) la cual indica y explica cada uno de los estadios de desarrollo de la cachama blanca. Esto con el fin de comparar el desarrollo normal y el desarrollo presentado en las diferentes concentraciones a los que los embriones serán expuestos; al igual que las malformaciones observadas.

5.6 Análisis de resultados

Para el análisis estadístico se empleara el programa STATISTICS versión 9.0 aplicando la prueba del chi cuadrado (X2).  Esto con el objeto de comparar y entender la dependencia de la mortalidad con el glifosato. También se utilizarán tablas y figuras con las que se determinará el número de individuos vivos y muertos de cachama blanca por cada una de las concentraciones de glifosato. Luego, para el análisis de las malformaciones se realizarán tablas y gráficas, con las cuales se podrá observar la presencia y ausencia de cada una de las malformaciones en las distintas concentraciones de glifosato. Además, se observará en qué punto del desarrollo embrionario fueronapareciendo las diferentes malformaciones.

Bibliografía

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Díaz Olarte, J., Marciales-Caro, L. J., Cristancho Vásquez, F., & Cruz-Casallas, P. E. (2010). Comparación del desarrollo embrionario de Piaractus brachypomus (Serrasalmidae) y Pseudoplatystoma sp. (Pimelodidae). International Journal of Morphology, 28(4), 1193-1204.

Eslava, P., W. Ramírez, & I. Rondón. (2007). Sobre los efectos del glifosato y sus mezclas: impacto en peces nativos. Universidad de los Llanos.

Labrador Nieto, J. E., Prada Reyes, H. D., Rengifo, C. A., Lapuente Chala, C., Rubio, C., & Angel, E. (2012). Estudio clínico-patológico de los efectos del glifosato (Roundup®) a niveles subletales en un modelo experimental murino.

Rondón-Barragán, I. S., Duarte, W. F. R., & Mocha, P. R. E. (2007). Evaluación de los efectos tóxicos y concentración letal 50 del surfactante Cosmoflux® 411F sobre juveniles de cachama blanca (Piaractus brachypomus). Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias, 20(4), 2.

Rondón-Barragán, I. S., Marin-Mendez, G. A., Chacón-Novoa, R. A., Naranjo-Suarez, L., Pardo-Hernández, D., & Eslava-Mocha, P. R. (2012). El glifosato (Roundup®) y Cosmoflux® 411F inducen estrés oxidativo en cachama blanca (Piaractus brachypomus). Orinoquia, 16(2 sup), 162-176.

Rondón-Barragán, I. S., Pardo-Hernández, D., & Eslava-Mocha, P. R. (2010). Efecto de los herbicidas sobre el sistema inmune: una aproximación en peces/effects of herbicides on immune system: an approach to fish. Revista Complutense de Ciencias Veterinarias, 4(1), 1.

Salazar-López, N. J., & Madrid, M. L. A. (2011). Herbicida Glifosato: Usos, toxicidad y regulación. Biotecnia, 13(2), 23-28.

Triana, T., C. Montes, & M. Bernal. (2013). Efectos letales y subletales del glifosato (Roundup® Activo) en embriones de anuros colombianos. Acta biológica Colombiana, 18(2), 271-278.

Ucros Garrido, A. M. (2009). Efectos del glifosato sobre el desarrollo embrionario de la trucha arco iris (Onchorhynchus mykiss) (Bachelor's thesis).

 

 

 

Autor:

Pulido, K.*,

Sánchez, A.M.*,

Polania, E.*,

Saavedra, M*

*: Estudiante pregrado Biología Universidad del Tolima

Semestre A (Marzo-Junio) 2017