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Separación de poblaciones celulares



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Poblaciones celulares en sangre entera Leucocitos Células nucleadas Se producen en medula ósea (humanos a un ritmo de 80 millones por minuto) Se pueden reconocer por sus propiedades de tinción y su estructura interna No granulosos Linfocito Heterogeneidad morfologica, 6-10um. Citoplasma basófilo muy escaso. Puede tener granulaciones escasas Nucleo redondo, oval o ligeramente escotado, se tiñe de color violeta y estructura compacta. Monocito Citoplasma basófilo. Tiene numerosas granulaciones pequeñas y distribuidas regularmente (no se ven con aumentos bajos) Nucleo lobulado en forma de herradura, violeta claro, no compacto
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Leucocitos polimorfonucleares Neutrófilo Citoplasma acidófilo color rosa pálido (con eosina ácida se tiñe de amarillo). Tiene granulaciones neutrofílicas chicas , regularmente distribuidas, abundantes; pueden ser primarios o secundarios Nucleo multilobulado 10-20um de diametro Tienen una vida media de 2-3 dias En humanos constituyen el 60-70% de los leucocitos totales de la sangre. No muestran ninguna especificidad para los antígenos pero desempeñan un Importante papel en la inflamación aguda Eosinófilo Citoplasma acidófilo con granulaciones acidófilas grandes, menos númerosas que en neutrofilos, distribución regular y muy refringentes Núcleo bilobulado en forma de anteojos, violeta oscuro y compacto. Basófilo Citoplasma acidófilo o antófilo (no toma colorante) granulaciones basófilas grandes,poco númerosas, distribución irregular de color azul violeta intensos. Núcleo lobulado, puede ser bisegmentado, violeta oscuro y compacto (Gp:) Basófilo
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Tinción de leucocitos en frotis Extendido de sangre en portaobjeto, dejar secar Coloración ideal: May Grunwald (azul de metileno/eosina) Tiñé citoplasma y granulaciones Giemsa (azul de metileno/eosina y azur) Tiñé el núcleo
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Sangre periférica Punción cardíaca Frotis Fórmula leucocitaria (en humanos) Tipos celulares Neutrófilos Linfocitos Basófilos Eosinófilos Monocitos En rata, el % de linfocitos es mayor al de neutrófilos (la relación se invierte)
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Fórmula leucocitaria Para determinar el porcentaje de los diferentes tipos celulares se cuenta un número fijo de células por frotis (por ejemplo 100), diferenciando los tipos celulares siguientes: linfocito, macrófago y granulocitos. La diferenciación celular se basa en la relación del tamaño núcleo/citoplasma, la morfología del núcleo y la coloración que adquiere el citoplasma. Barrer el preparado en guarda griega porque las células no se distribuyen homogéneamente: linfocitos en franja central, monocitos y polimorfos nucleares en el borde. Las proporciones de la fórmula leucocitaria varían según: * Edad *especie (humanos predominan los neutrófilos, rata predominan los linfocitos)
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(Gp:) Ganglios axilares (Gp:) Timo (Gp:) Ganglios mesentéricos (Gp:) Ganglios inguinales (Gp:) Placas de Peyer (Gp:) Bazo (Gp:) Ganglios linfáticos órganos linfoides secundarios. Linfocitos T 77 % Linfocitos B 18 % (Gp:) Timo órgano linfoide primario. Linfocitos T 97 % Linfocitos B 1 % (Gp:) Médula ósea órgano linfoide primario. Generación de células del SI. Capacidad hematopoyética (Gp:) Médula ósea (Gp:) Bazo órgano linfoide secundario. Linfocitos T 35 % Linfocitos B 38 % (Gp:) Sangre Linfocitos T 70 % Linfocitos B 24 % (Gp:) Obtención de células de órganos linfoides
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(Gp:) Preparación de suspensiones celulares (Gp:) Obtención de M.O. (Gp:) RPMI 1640 (Gp:) Obtención de células linfoides (Gp:) Centrifugar Resuspender en medio de cultivo Contar (Gp:) Timo Bazo Ganglios
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Recuento de células Determinación de la concentración de células en una suspensión cámara de Neubauer (Gp:) Nº de células/ml= (Gp:) ?n (Gp:) 4 (Gp:) X 10 x dil (Gp:) 4
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Separación de poblaciones celulares Un método eficiente debe reunir : Buena recuperación Alta pureza Mantenimiento de la funcionalidad celular Sirven para: enriquecer o depletar una población de células
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Métodos basados en tamaño y densidad Velocidad de sedimentación a 1 x g Ley de Stokes: Fuerza de fricción experimentada por objetos esféricos moviéndose en un fluido viscoso en un régimen laminar de bajo número de Reynolds (Re< 2000). Una célula que sedimenta obedeciendo la Ley de Stokes (en general es válida para partículas pequeñas moviéndose a velocidades bajas), llega a una velocidad terminal dada por: (Gp:) 2 g (? - ?´) r2 (Gp:) V = (Gp:) 9 ? Densidad de la célula Densidad del medio Radio de la célula Viscosidad del medio Constante gravitacional La temperatura puede modificar la velocidad de sedimentación alterando la viscosidad
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Densidad celular El diámetro influye más que la densidad de la célula en la determinación de la velocidad de sedimentación
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Separación en base al tamaño principalmente (medio de baja densidad) Ventajas: Buena reproducibilidad Buena recuperación Puede separar una gran cantidad de células Desventaja: Tiempo requerido para la separación
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Separación en base a la densidad Centrifugación en gradiente de densidad: ?utiliza un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. ?el gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar puede ser suspendida ?permite separar los componentes de una muestra ?realizar medidas analíticas Dos variantes: Centrifugación zonal: la muestra se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrifuga las partículas sedimentan moviéndose a diferentes velocidades dependiendo de su masa. Centrifugación isopícnica : la muestra se disuelve en una sn en donde está el soluto formador del gradiente. Durante la centrifugación el soluto se distribuye en el tubo y las particulas de la muestra se reorientan de acuerdo a su densidad. (sedimentación a altas g a través de un medio cada vez más denso)
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Cuando la densidad del medio y de las células son iguales, entonces v = 0 y la célula flota en una posición de equilibrio. Las células muy densas llegan al fondo del tubo y pueden morir por compresión. Las células muertas también son muy densas y llegan al fondo del tubo. Se utilizan altas g para alcanzar más rápido el equilibrio y evitar mezclas por efectos de difusión. Cuanto mayor es la relación núcleo : citoplasma, mayor es la densidad de la célula Medio hipotónoico: células menos densas; medio hipertónico: células más densas Se utilizan gradientes de BSA lineales o discontinuos y sílica gel coloidal, Percoll.
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Separación en base a tamaño y densidad (Hypaque-Ficoll) Separación de una suspensión celular a través de un medio de alta densidad por centrifugación a baja velocidad Ficoll. Se trata de un polisacárido sintético de alto peso molecular (400 kDa). Presenta un alto contenido en grupos hidroxilo por lo que tiene una buena solubilidad en medios acuosos. Además no presenta grupos ionizables que puedan servir de unión a las muestras. Es estable a pH neutro y alcalino, pudiendo ser autoclavado sin degradarse. Su viscosidad es menor que la de la sacarosa, aunque sigue siendo algo elevada, lo que supone un inconveniente y no altera la presión osmótica del medio. Debido a sus propiedades, el ficoll se ha utilizado para la separación de células y partículas subcelulares mediante centrifugación zonal. Densidad del medio para células humanas : 1,075 g/cm3 ratón : 1,09 g/cm3 rata: 1,089 g/cm3
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(Gp:) (C12H22O11)n.(C3H5ClO)n PM: 400.000 (Gp:) Ficoll (Gp:) Hypaque (Gp:) Polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina (Gp:) Hypaque sódico (diatrizoato sódico) (Gp:) sodio 3,5-diacetamido-2, 4, 6-triiodobenzoate (C11H8I3N2NaO4) contiene 59.87 % de Iodo
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(Gp:) Obtención de células mononucleares de sangre periférica por Ficoll- Hypaque (Gp:) Antes de centrifugar (Gp:) Sangre diluida (Gp:) Ficoll Hypaque (Gp:) Centrifugación (Gp:) Plasma y plaquetas (Gp:) Mononucleares (Gp:) Ficoll Hypaque (Gp:) Polimorfonucleares + Glóbulos rojos (Gp:) Mononucleares: Linfocitos + monocitos (Gp:) 400 g 30´ temp amb (Gp:) Después de centrifugar