(Gp:) Purificación de PMN provenientes de Ficoll-Hypaque
(Gp:) Por sedimentación sobre dextran 6 %
(Gp:) Lisis con H2O (1’) Llevar a isotonicidad
(Gp:) PMN + GR *
(Gp:) GR
(Gp:) Dextran
(Gp:) PMN + GR + SF
(Gp:) Agitación por inversión y sedimentación por 30’
El dextran es un polisacárido complejo y ramificado formado por muchas moléculas de glucosa unidades en cadenas de longitud variable (de 10 a 150 kDa). La cadena consiste en uniones glucosídicas a1->6 entre moléculas de glucosa, mientras que las ramificaciones empiezan en uniones a1->4 (en algunos casos también en uniones a1->2 y a1->3). El dextrano es sintetizado a partir de la sacarosa por ciertas bacterias ácido-lácticas( Leuconostoc mesenteroides y Streptococcus mutans).
Separación de células sanguíneas humanas por centrifugación en gradiente de Percoll
Cuando la densidad del medio y de las células son iguales, entonces v = 0 y la célula flota en una posición de equilibrio.
(Gp:) Mononucleares (linfocitos)
(Gp:) GR
(Gp:) PMN
(Gp:) 70 % (1083)
(Gp:) 60 % (1077)
(Gp:) 50 % (1065)
(Gp:) Plasma Monocitos, NK
Gradiente de Percoll (50-70 %): Buena recuperación y pureza mayor al 90 %
Percoll.
Se trata de una suspensión de partículas (5.15 nm) de ácido silícico revestidas de un derivado de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP) que presenta baja viscosidad a densidades altas, no afecta prácticamente a la presión osmótica del medio y es estable a pH comprendidos entre 5 y 10.
Es soluble en solución acuosa y estable en ellas siempre que no haya aniones bivalentes (sulfato), especialmente a bajos pH.
El compuesto puede ser utilizado para centrifugaciones zonales, preformando gradientes, o bien para centrifugación isopícnica, ya que la centrifugación de percoll en rotores angulares durante 20-30 minutos y 20.000-100.000g produce un ligero gradiente, independientemente de la densidad inicial del percoll.
Métodos basados en adherencia
3 categorías:
1- Adherencia activa: Requiere del metabolismo celular y es temperatura dependiente (ej: macrófagos, polimorfonucleares)
2- Adherencia física: Se puede realizar a 4 °C o a 37 °C (ej: subsets de células B)
3- Adherencia de células muertas o dañadas
Sustancias empleadas:
Sephadex G10: Quedan retenidas las células adherentes.
La separación se basa en adherencia y tamaño.
Polvo de hierro (Carbonyl iron powder): Las células que fagocitan o se adhieren a las partículas de hierro, son removidas con un imán. (ej: Remoción de linfocitos B)
Lana de nylon: Se utiliza para obtener células T libres de células B.
El rendimiento es bajo (15 a 25 %).
Puede haber retención diferencial de subpoblaciones T.
Adherencia a superficies de vidrio o plástico
(Gp:) Adherencia a lana de nylon
(Gp:) Rendimiento bajo (15-25 %)
Alta pureza.
(Gp:) Métodos basados en adherencia
(Gp:) Adherencia a superficies de vidrio o plástico
(Gp:) * Purificación de macrófagos (células adherentes)
* Separación por agentes químicos (quelante de calcio, EDTA o tripsina) o por rastrillado.
(Gp:) * Purificación de linfocitos T
Métodos basados en afinidad (Interacción receptor-ligando)
*Rosetas
*Columnas con anticuerpos
*Panning: superficies plásticas recubiertas con anticuerpo
*Beads magnéticas
*Aglutinina de maní: interacciona con residuos D-galactosa de timocitos inmaduros, aglutinando las células (las células maduras presentan éstos residuos enmascarados por ácido siálico.
*Aglutinina de soja: aglutina células B pero no células T.
*FACS
(Gp:) Monocitos + LB
(Gp:) Métodos basados en afinidad (Interacción receptor-ligando)
(Gp:) Rosetas espontáneas
(Gp:) Ficoll-Hypaque
(Gp:) GRc
(Gp:) GRc
(Gp:) GRc
(Gp:) GRc
(Gp:) GRc
(Gp:) LT
(Gp:) Roseta
(Gp:) GRc
(Gp:) CD 2
(Gp:) Rosetas T
(Gp:) LT (humanos)
(Gp:) A partir de interfase de Ficoll- Hypaque
Métodos basados en afinidad
(Gp:) Panning
(Gp:) Utilización de pequeñas beads recubiertas con anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a los linfocitos T o B. Una vez hecha la unión las células se extraen con la ayuda de un separador magnético. La pureza es excelente. Se trabaja a temperatura ambiente
(Gp:) Beads magnéticas
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) Y
(Gp:) superficies plásticas recubiertas con anticuerpos
(Gp:) CD 19 (Linfocito B)
(Gp:) CD 3 (Linfocito T)
(Gp:) Selección positiva
Selección negativa
Técnicas inmunomagnéticas
Receptor de la superficie celular que se combina con un ligando (basado en la especificidad de la interacción)
Antisuero + complemento: Eliminación de una subpoblación que lleva un antígeno de membrana específico.
Método basado en filtración por columna de bolitas de vidrio
53 a 65 µ de diámetro
Las células más grandes se retrasan con respecto a las más pequeñas.
El vidrio debe estar siliconado
Metodo basado en carga eléctrica neta
En roedores hay una distribución bimodal de movilidades correspondiendo a células B y T.
En humanos esa distribución no se puede correlacionar con las poblaciones B y T
Otros métodos de separación
Métodos basados en la separación funcional por inactivación de células proliferantes
1- Pulso de timidina marcada con radioisótopos
Linfocitos expuestos a Ag o mitógenos se dividen y la timidina se incorpora al ADN
La desintegración radioactiva mata las células proliferantes.
(Reacciones mixtas de linfocitos, respuestas citotóxicas mediadas por células).
(Gp:) La timidina se incorpora al ADN celular
X
2- Pulso de 5-Br-2-Deoxiuridina (BUdR)
Se incorpora al ADN en células en división como análogo de la timidina. Cuando se activa con luz UV, causa el daño del ADN.
3- Mitomicina C
Causa cross-linking del ADN y las funciones que requieren división celular son abolidas
4- Irradiación
Rayos X, Cobalto (60Co), Cesio (137Cs), rayos gamma.
X
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